鹽霉素增強吉非替尼誘導(dǎo)人肺腺癌細胞株A549凋亡的作用*

曾 葭，陳小宇，祝愛珍，劉成成，譚廣銷，劉革修△

(1解放軍第411醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200081;2暨南大學醫(yī)學院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

以鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合化療方案和表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitor，EGFR-TKI)是當前針對EGFR基因非突變或突變的晚期非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)患者首選治療措施[1-3]，但由于存在繼發(fā)耐藥與復(fù)發(fā)問題，延長患者生存期的作用有限[4-6]。如何克服耐藥已成為目前研究熱點之一[7-9]。最近研究發(fā)現(xiàn)一種名為鹽霉素(salinomycin)的抗生素可以殺死腫瘤干細胞，克服耐藥，其效力比普通抗癌藥物泰克索(taxol)高100倍[10-13]。我們前期研究顯示，鹽霉素能誘導(dǎo)人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP凋亡[14]。本實驗將進一步探討鹽霉素聯(lián)合吉非替尼誘導(dǎo)人肺腺癌細胞株A549凋亡的協(xié)同作用，為鹽霉素應(yīng)用于肺腺癌治療探索新的思路。

材料和方法

1 材料

人肺腺癌細胞株A549由本實驗室保存。鹽酸吉非替尼購自湖北老百姓藥業(yè)有限公司，鹽霉素和PI染料購自Sigma;RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自 Gibco;細胞內(nèi)活性氧、caspase-3、caspase-8、caspase-9活性以及JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;細胞色素C凋亡檢測試劑盒為BioVision;Fluo-3AM購自Biotium;Epics XL型流式細胞儀為Beckman Coulter產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 以每瓶1×105細胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，采用含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液置于含5%CO2、飽和濕度、37℃孵箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代。當細胞生長至約70%融合度時用于實驗。

2.2 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期細胞以每孔180 μL(5×103細胞)接種于96孔板，細胞貼壁后，分別加入鹽霉素(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 和 3.20 μmol/L)、吉非替尼(0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、8.0 和 16.0 μmol/L)以及吉非替尼(0.50 μmol/L)聯(lián)合不同濃度的鹽霉素(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 和 3.20 μmol/L)，進行藥物干預(yù)，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。同時設(shè)空白對照組、僅含有DMSO的溶媒對照組。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，37℃培養(yǎng)4 h后低速離心10 min吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min使沉淀充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm處測定吸光度(A)值。細胞生長抑制率(%)=(實驗組平均A值-空白組平均A值)/(對照組平均A值-空白組平均A值)×100%。采用直線回歸方法計算藥物的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。實驗重復(fù)3次。

2.3 計算鹽霉素和吉非替尼的聯(lián)合作用效果 根據(jù)中效原理，采用Chou-Talalay聯(lián)用指數(shù)法判定2種藥物的聯(lián)合作用。按中效方程式計算出不同抑制率時兩藥的單用和聯(lián)用濃度，公式如下:D=Dm[fa/(1-fa)]1/m;式中D為藥物濃度，Dm為中效濃度，fa為細胞生長抑制率，m為斜率。2種藥物的聯(lián)用指數(shù)(combination index，CI)的計算公式如下:CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+a(D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2;其中(Dx)1和(Dx)2分別為2種藥物單用時產(chǎn)生某一效應(yīng)值fa時的濃度，(D)1和(D)2則是2種藥物聯(lián)用時產(chǎn)生相同效應(yīng)fa時各自所需要的濃度。當2種藥物的相互作用為非排斥性時，a=1;當2種藥物的相互作用為排斥性時，a=0。求出CI值，如果CI＜1，認為兩藥物聯(lián)用為協(xié)同作用;如果CI=1，認為兩藥聯(lián)用為相加作用;如果CI＞1，則認為兩藥聯(lián)用為拮抗作用。

2.4 Annexin V-PI雙染測定細胞凋亡 取對數(shù)生長的A549細胞，每孔2×105個細胞接種至6孔板內(nèi)，設(shè)(0.2 μmol/L)鹽霉素處理組、鹽霉素(0.2 μmol/L)與吉非替尼(0.50 μmol/L)聯(lián)合處理組、單純吉非替尼(0.50 μmol/L)組，以及DMSO對照組，作用48 h后，消化收集細胞，PBS洗滌，棄上清，加入200 μL試劑盒提供的結(jié)合緩沖液，重懸細胞后，分別加入 10 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，輕輕混勻，4℃避光反應(yīng)30 min，再加入300 μL結(jié)合緩沖液，上機檢測。

2.5 線粒體膜電位、活性氧和胞質(zhì)Ca2+釋放的檢測取對數(shù)生長期的A549細胞，以2×105cells/well接種至12孔板，設(shè)有上述4組，在6、12、24 h時收集細胞，PBS洗滌2遍。500 μL JC-1(10 mg/L)重懸細胞檢測線粒體膜電位，500 μL DCFH-DA(5 μmol/L)重懸細胞檢測細胞內(nèi)活性氧，10 μmol/L熒光染料Fluo-3AM檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度，37℃避光孵育20 min，PBS洗3次，即刻用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。

2.6 Caspase-3、caspase-8和caspase-9活性檢測取對數(shù)生長期的A549細胞，以2×105cells/well的密度接種至6孔板，設(shè)有上述4組，分別處理6、12、24 h，按照試劑盒說明收集細胞，預(yù)冷PBS洗滌后重懸于細胞裂解液中，冰上裂解30 min，4℃下10000×g離心10 min，取上清加入顯色底物(caspase-3底物Ac-DEVD-pNA，caspase-8底物Ac-IETD-pNA，caspase-9 底物 Ac-LEHD-pNA)，終濃度50 μL/L，均勻混合并加入到96孔板中，每組5個復(fù)孔，避光孵育4 h，酶標儀在波張405 nm處檢測吸光度(A)值。

2.7 Western blotting檢測 處理48 h后，收集并PBS洗2遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白;細胞色素C測定是按試劑盒抽提胞漿及線粒體蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑測定蛋白濃度，取蛋白50 μg，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉液(20 mmol/L Tris pH 7.6，0.1%Tween 20)封閉過夜。兔抗Akt抗體(H-136)、鼠抗人細胞色素 C、Bcl-2抗體(Santa Cruz)、p-EGFR、p-Akt和 p-ERK 抗體 (Cell Signaling Technology)或GAPDH(Chemicon International)4℃孵育過夜，1∶2000稀釋的HRP標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，用TBST洗3次，ECL顯色液顯色。目的條帶用Image-Pro Plus分析軟件進行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參照校正。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 鹽霉素與吉非替尼對A549細胞增殖的抑制作用

鹽霉素與吉非替尼分別以不同濃度單獨作用于A549細胞72 h，均顯示抑制增殖作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性，見圖1，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。鹽霉素的IC50值為(0.47±0.07)μmol/L，而吉非替尼的 IC50值為(2.93 ±0.13)μmol/L。根據(jù)合用指數(shù)計算公式，計算出吉非替尼和鹽霉素合用在不同效應(yīng)(0.90、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.50 和 0.40)時的 CI分別為 0.473、0.482、0.545、0.667、0.741、0.864、0.938 和 0.949即當 fa 為 0.90、0.80、0.75、0.65、0.60、0.50 和 0.40時兩藥合用為協(xié)同作用。

Figure1.Growth inhibitory rates of A549 cells treated with salinomycin and gefitinib at different concentrations，alone or in combination.A:salinomycin;B:gefitinib;C:salinomycin and gefitinib..n=5.*P＜0.05 vs salinomycin alone at corresponding concentration.圖1 不同濃度鹽霉素與吉非替尼單用或合用對A549細胞的生長抑制率

2 鹽霉素與吉非替尼單獨或聯(lián)合作用對A549細胞凋亡的影響

鹽霉素(0.2 μmol/L)或吉非替尼(0.50 μmol/L)分別單獨作用A549細胞72 h后，細胞凋亡率分別為(11.81±2.27)%和(8.53±2.24)%，顯著高于DMSO對照組(4.85±2.21)%，P＜0.05;而鹽霉素(0.2 μmol/L)和吉非替尼(0.50 μmol/L)聯(lián)合作用A549細胞的凋亡率為(26.74±3.59)%，高于單獨用藥組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2。由此可見，聯(lián)合應(yīng)用鹽霉素可增強吉非替尼誘導(dǎo)A549細胞凋亡的作用。

Figure2.f Effects of salinomycin and gefitinib，alone or in combination，on apoptosis of A549 cells.圖2 鹽霉素與吉非替尼單獨或聯(lián)合作用對A549細胞凋亡的影響

3 鹽霉素與吉非替尼單獨或聯(lián)合作用對A549細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的影響

0.2μmol/L的鹽霉素作用于A549細胞之后，線粒體膜電位在6 h時已顯著下降，24 h時下降至最低，為對照組的(35.1±3.6)%;細胞內(nèi)活性氧在6 h時已顯著升高，24 h時仍然高于對照組水平(130.3±5.5)%;細胞內(nèi)Ca2+在6 h時已顯著升高，為對照組的(152.7±5.5)%，24 h時下降至接近對照組水平。0.5 μmoL/L吉非替尼單獨作用對A549細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+沒有影響。鹽霉素與吉非替尼聯(lián)合作用則可進一步改變A549細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)，見圖3、表1。

Figure3.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on mitochondria membrane potential in A549 cells.圖3 鹽霉素與吉非替尼單獨或聯(lián)合作用對A549細胞線粒體膜電位的影響

表1 鹽霉素與吉非替尼單獨或聯(lián)合作用對A549細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的影響Table1.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on mitochondrial membrane potential(MMP)，ROS and Ca2+in A549 cells(%..n=5)

表1 鹽霉素與吉非替尼單獨或聯(lián)合作用對A549細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的影響Table1.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on mitochondrial membrane potential(MMP)，ROS and Ca2+in A549 cells(%..n=5)

＊＊ P ＜0.01 vs Sal;△△P ＜0.01 vs Gef.

2+MMP ROS Ca 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h Sal 84.2±5.9 58.3±4.6 32.7±3.9 150.8±5.9 134.5±5.7 127.5±5.6 155.2±5.6 101.8±5.7 99.8±5 Group.7 Sal+gef 74.9±6.0＊＊△△ 46.8±4.5＊＊△△ 21.8±3.9＊＊△△153.0±5.9＊＊△△131.8±5.7＊＊△△116.1±5.6＊＊△△150.3±5.6△△ 99.4±5.7△△ 99.6±5.7△△Gef 100.8±5.8 98.9±5.8 101.2±5.8 99.8±5.5 99.6±5.5 100.9±5.5 100.1±5.5 99.4±5.5 101.4±5.5

4 鹽霉素與吉非替尼單獨或聯(lián)合作用對A549細胞caspase－3、caspase－8和 caspase－9活性的影響

0.2μmol/L鹽霉素處理A549細胞后，隨著時間的增加，caspase-3、caspase-8和caspase-9活性增加，呈時間-效應(yīng)關(guān)系，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表2。這一結(jié)果表明，caspase-3、caspase-8和caspase-9參與了鹽霉素誘導(dǎo)的凋亡途徑。

表2 鹽霉素與吉非替尼單用或合用對A549細胞caspase－3、caspase－8和caspase－9活性的影響Table2.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on the activity of caspase-3，caspase-8 and caspase-9 in A549 cells(%..n=5)

表2 鹽霉素與吉非替尼單用或合用對A549細胞caspase－3、caspase－8和caspase－9活性的影響Table2.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on the activity of caspase-3，caspase-8 and caspase-9 in A549 cells(%..n=5)

＊＊P ＜0.01 vs Sal;△△P ＜0.01 vs Gef.

GroupCaspase-3 Caspase-8 Caspase-96 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h Sal 115.3±5.1 128.7±5.2 134.8±5.2 156.9±5.8 161.6±5.8 159.4±5.8 137.5±5.4 148.0±5.4 152.9±5.4 Sal+Gef 126.0±5.2＊＊△△ 155.1±5.2＊＊△△ 167.4±5.2＊＊△△ 164.3±5.8＊＊△△ 180.2±5.8＊＊△△ 174.1±5.8＊＊△△ 156.8±5.4＊＊△△ 165.6±5.4＊＊△△ 176.7±5.4＊＊△△Gef 102.7±5.1 118.5±5.1 121.8±5.1 110.7±5.7 119.8±5.7 109.6±5.7 108.3±5.3 118.5±5.3 120.8±5.3

5 鹽霉素與吉非替尼單獨或聯(lián)合作用對A549細胞Bcl－2、細胞色素 C、p－EGFR、p－Akt和 p－ERK蛋白水平影響

鹽霉素(0.2 μmol/L)單獨作用A549細胞，雖然對EGFR、Akt和ERK總蛋白水平無顯著影響，但是Bcl-2表達下調(diào)，而且胞漿細胞色素C顯著增加，p-EGFR、p-Akt和p-ERK蛋白水平也顯著下降;吉非替尼(0.50 μmol/L)單獨作用，不僅Bcl-2表達下調(diào)，而且p-EGFR、p-Akt和p-ERK蛋白水平下降更明顯，胞漿細胞色素C增加量少;鹽霉素與吉非替尼聯(lián)合作用，則Bcl-2、p-EGFR、p-Akt和 p-ERK 蛋白水平進一步下降，而且胞漿細胞色素C上升更高，見圖4。這一結(jié)果說明聯(lián)合應(yīng)用鹽霉素可通過多種途徑增強吉非替尼誘導(dǎo)A549細胞凋亡的作用。

討 論

本研究結(jié)果顯示，鹽霉素或者吉非替尼單用雖然均顯示對A549細胞有不同程度的增殖抑制作用和誘導(dǎo)細胞凋亡作用，但它們聯(lián)用則顯示了更強的協(xié)同作用，鹽霉素提高吉非替尼誘導(dǎo)A549細胞凋亡作用。該協(xié)同作用與鹽霉素和吉非替尼各自藥理特性有關(guān)。鹽霉素屬于聚醚類一元羧酸，由白色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是典型的離子載體抗生素，它對細胞中的陽離子，尤其是K+、Na+和Rb+的親和力特別強，使生物所必需的陽離子通過膜上脂質(zhì)屏障的浸透性增強，妨礙細胞內(nèi)外陽離子的傳遞，使細胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化，從而影響細胞內(nèi)生命活動，可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線粒體凋亡途徑[15-17]。本研究顯示鹽霉素能增加細胞內(nèi)活性氧，降低線粒體膜電位，促進線粒體細胞色素C釋放，使caspase-3、-8和-9酶激活，誘導(dǎo)細胞凋亡，與我們前期研究結(jié)果一致[14]。吉非替尼屬于小分子的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，其通過競爭性地與EGFR酪氨酸激酶催化區(qū)域中的Mg-ATP位點結(jié)合，抑制酪氨酸激酶磷酸化，阻斷EGFR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制細胞周期進程，加速細胞凋亡[18-22]。EGFR屬于Ⅰ型生長因子家族，具有酪氨酸激酶活性，可通過下游多種信號通路調(diào)節(jié)細胞活性，如有促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/ERK、PI3K/Akt及 Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路等。許多研究證實EGFR信號通路參與了腫瘤細胞浸潤、血管生成、細胞增殖和凋亡抵抗等。本研究顯示，吉非替尼單用則主要通過抑制p-EGFR、p-Akt和p-ERK蛋白表達，抑制細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，而對胞漿細胞色素C、caspase-3、-8和-9酶活性影響較少。所以，鹽霉素與吉非替尼合用具有協(xié)同作用。這與2種藥物在作用機理上具有互補作用密切相關(guān)。該結(jié)果為改善肺腺癌臨床治療方法提供新的依據(jù)。但如何應(yīng)用鹽霉素于肺腺癌臨床治療還有待進一步研究。

Figure4.Effects of salinomycin(Sal)and gefitinib(Gef)，alone or in combination，on the protein levels of Bcl-2，cytochrome C，p-EGFR，p-Akt，p-ERK，EGFR，Akt and ERK in A549 cells.Con:control..n=5.*P＜0.05 vs Con.圖4 鹽霉素與吉非替尼單獨或聯(lián)合作用對A549細胞中Bcl－2、cytochrome C、p－EGFR、p－Akt、p－ERK、EGFR、Akt和ERK蛋白水平的影響

[1]Goldstraw P，Ball D，Jett JR，et al.Non-small-cell lung cancer[J].Lancet，2011，378(9804):1727-1740.

[2]Van Schil PE，Hendriks JM，Hertoghs M，et al.Current surgical treatment of non-small-cell lung cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther，2011，11(10):1577-1585.

[3]Pennell NA.Integration of EGFR inhibitors and conventional chemotherapy in the treatment of non-small-cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer，2011，12(6):350-359.

[4]Stella GM，Luisetti M，Inghilleri S，et al.Targeting EGFR in non-small-cell lung cancer:lessons，experiences，strategies[J].Respir Med，2012，106(2):173-183.

[5]Cataldo VD，Gibbons DL，Pérez-Soler R，et al.Treatment of non-small-cell lung cancer with erlotinib or gefitinib[J].N Engl J Med，2011，364(10):947-955.

[6]Gridelli C，De Marinis F，Di Maio M，et al.Gefitinib as first-line treatment for patients with advanced non-small-cell lung cancer with activating epidermal growth factor receptor mutation:Review of the evidence[J].Lung Cancer，2011，71(3):249-257.

[7]Liu S，Wang D，Chen B，et al.The safety and efficacy of EGFR TKIs monotherapy versus single-agent chemotherapy using third-generation cytotoxics as the first-line treatment for patients with advanced non-small cell lung cancer and poor performance status [J].Lung Cancer，2011，73(2):203-210.

[8]Kosaka T，Yamaki E，Mogi A，et al.Mechanisms of resistance to EGFR TKIs and development of a new generation of drugs in non-small-cell lung cancer[J].J Biomed Biotechnol，2011，2011:165214.

[9]Lin CC，Yang JC.Optimal management of patients with non-small cell lung cancer and epidermal growth factor receptor mutations[J].Drugs，2011，71(1):79-88.

[10]Gupta PB，Onder TT，Jiang G，et al.Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening[J].Cell，2009，138(4):645-659.

[11]Fuchs D，Heinold A，Opelz G，et al.Salinomycin induces apoptosis and overcomes apoptosis resistance in human cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，390(3):743-749.

[12]Riccioni R，Dupuis ML，Bernabei M，et al.The cancer stem cell selective inhibitor salinomycin is a p-glycoprotein inhibitor[J].Blood Cells Mol Dis，2010，45(1):86-92.

[13]Zhi QM，Chen XH，Ji J，et al.Salinomycin can effectively kill ALDHhighstem-like cells on gastric cancer[J].Biomed Pharmacother，2011，65(7):509-515.

[14]曾 葭，劉成成，祝愛珍，等.鹽霉素抑制人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP增殖及誘導(dǎo)凋亡的機制[J].中國病理生理雜志，2012，28(5):834-838.

[15]Kim JH，Yoo HI，Kang HS，et al.Salinomycin sensitizes antimitotic drugs-treated cancer cells by increasing apoptosis via the prevention of G2 arrest[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，418(1):98-103.

[16]Ketola K，Hilvo M，Hy?tyl?inen T，et al.Salinomycin inhibits prostate cancer growth and migration via induction of oxidative stress[J].Br J Cancer，2012，106(1):99-106.

[17]Kim KY，Yu SN，Lee SY，et al.Salinomycin-induced apoptosis of human prostate cancer cells due to accumulated reactive oxygen species and mitochondrial membrane depolarization[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，413(1):80-86.

[18]Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J].N Engl J Med，2004，350(21):2129-2139.

[19]Paez JG，J?nne PA，Lee JC，et al.EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefitinib therapy[J].Science，2004，304(5676):1497-1500.

[20]Kancha RK，von Bubnoff N，Peschel C，et al.Functional analysis of epidermal growth factor receptor(EGFR)mutations and potential implications for EGFR targeted therapy[J].Clin Cancer Res，2009，15(2):460-467.

[21]Tiseo M，Rossi G，Capelletti M，et al.Predictors of gefitinib outcomes in advanced non-small cell lung cancer(NSCLC):study of a comprehensive panel of molecular markers[J].Lung Cancer，2010，67(3):355-360.

[22]Chang MH，Ahn HK，Lee J，et al.Clinical impact of amphiregulin expression in patients with epidermal growth factor receptor(EGFR)wild-type nonsmall cell lung cancer treated with EGFR-tyrosine kinase inhibitors[J].Cancer，2011，117(1):143-151.