HIV gp41融合多肽對抗原特異性Treg活化的抑制作用

胡義平，賀龍剛，李潤明，李珉珉，張嘉杰，劉叔文，李曉娟

(1.南方醫(yī)科大學藥學院，廣東廣州 510515;2.暨南大學附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510630)

HIV感染引起的艾滋病，在中國乃至全世界都屬于重大疾病，卻無有效的預防性疫苗。由于HIV主要感染CD4+T淋巴細胞，病毒與免疫細胞的相互作用是疾病研究的關鍵［1］。在CD4+T細胞，具有免疫抑制作用的CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg)與 HIV 感染密切相關［2－3］:Treg 比 CD4+記憶性T細胞更易感染HIV;感染早期，病毒抗原刺激產(chǎn)生的特異性Treg，聚集在人體內HIV復制的主要部位淋巴結;Treg數(shù)目在早期和進展病人中升高，隨后不斷減少，到艾滋病后期大量耗竭［4］。

HIV gp41融合多肽(fusion peptide，F(xiàn)P)可以插入CD4+T細胞膜，啟動病毒與靶細胞膜的融合，實現(xiàn)病毒的感染［5］。此外，F(xiàn)P還能通過插入人和小鼠細胞膜，與TCR結合，影響抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APC)遞呈的活化信號與TCR交聯(lián)，抑制抗原特異性CD4+T細胞的活化［6］。Treg活化也需要 TCR 的信號［7－8］，然而 FP 能否因此影響抗原特異性的Treg細胞活化未見報道。

本研究中，我們分離DO11.10 OVA轉基因小鼠CD4+CD25+Treg，用OVA刺激抗原特異性Treg細胞活化［9］，觀察FP多肽對Treg細胞活化后免疫抑制功能、相關細胞因子IL-10表達的影響;由于FP也可以插入小鼠的細胞膜［6］，我們檢測Treg細胞表面FP與TCR的共分布情況，初步探討FP對抗原特異性Treg活化的影響。本研究將有助于深入理解HIV病毒與機體的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DO11.10轉基因小鼠(♀，6～12周齡)，購自南京大學遺傳動物所，清潔級BALB/c近交系小鼠(♀性，6～8周齡)購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和β-二巰基乙醇購自美國Gibco公司產(chǎn)品。CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑盒購自日本Dojindo化學研究所，二抗AlexFluo 488 goatanti-mouse IgG2a購自美國 Invitrogen公司。Anti-Mouse DO11.10 TCR FITC(Clone:KJ1-26)、小鼠IL-10的ELISA檢測試劑盒，CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞檢測試劑盒購自美國eBioscience公司。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞MACS磁珠分離試劑盒購自德國美天旎公司。FP1-25(AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL)、FP-Rho、FP 對照多肽(VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED，F(xiàn)P Scram)由以色列魏茲曼研究所 Yechiel Shai實驗室提供。OVA323-339由上海強耀公司合成。

1.2 方法

1.2.1 CD4+CD25+調節(jié)性 T 細胞和 CD4+CD25－效應性T細胞的分離和檢測 分離小鼠脾臟細胞，按MACS磁珠分離試劑盒說明書獲得純化的CD4+CD25－效應性T細胞(Teff)和CD4+CD25+Treg細胞;分離前后 CD4+CD25－、CD4+CD25+T細胞純度用流式細胞儀檢測，分離前Treg細胞Foxp3檢測按試劑盒說明進行［10］。

1.2.2 CCK-8 法分析 CD4+CD25－效應性 T 細胞增殖 CD4+CD25－效應性T細胞按5×104/孔加入96孔板里，加或不加CD4+CD25+調節(jié)性 T細胞(2.5×104/孔)，再加入3×105/孔絲裂霉素 C(mitomycin C)處 理 的 小 鼠 脾 細 胞 作 為 APC［11］。OVA323-339 終濃度為 100 μg·L－1，F(xiàn)P 和對照多肽為25 mg·L－1。培養(yǎng)3 d后，結束前4 h每孔加入20 μl CCK-8，每組設3個復孔，檢測OD450反映CD4+CD25－T細胞增殖。由于Treg細胞具有免疫無能性，受抗原等刺激后不增殖，而經(jīng)過絲裂霉素C處理后的小鼠脾細胞也失去增殖活性，在絲裂原等刺激下不增殖，只保留其遞呈抗原的功能。因此，我們通過CCK-8法檢測的主要是CD4+CD25－Teff細胞的增殖，同時反映出Treg體外抑制Teff增殖的功能。

1.2.3 ELISA分析 Treg細胞 IL-10的分泌 5×104個DO11.10小鼠 CD4+CD25+Treg細胞與3×105個 APC(同上)加入96孔板中，加 OVA323-339和FP多肽共培養(yǎng)，3 d后收集上清，ELISA檢測上清IL-10分泌。

1.2.4 熒光共聚焦檢測Treg細胞表面FP和TCR的分布 磁珠分離DO11.10 OVA Tg小鼠脾臟Treg，按5×104/孔加入96孔板，加入 3×105/孔絲裂霉素C處理的BALB/C小鼠脾臟細胞作為APC，加 OVA323-339 100μg·L－1刺激 3 d。收集細胞后用4%多聚甲醛固定，加抗DO11.10小鼠OVA TCR抗體和抗TCR抗體的二抗孵育，孵育的最后5 min加入FP-RHO。細胞用PBS離心沖洗后加到玻璃片上，熒光共聚焦檢測細胞膜表面TCR和FP的分布情況。

2 結果

2.1 CD4+CD25+調節(jié)性T細胞和CD4+CD25-效應性T細胞的分離后純度檢測［11］磁珠分選前后進行細胞的流式細胞儀檢測:Fig 1A為分選前的小鼠脾細胞CD4+CD25+調節(jié)性T細胞和CD4+CD25－效應性T細胞比例;以 CD4+CD25+雙陽性圈出設門，分析Foxp3的表達(Fig 1B)，表明CD4+CD25+T細胞確為高表達Foxp3的天然調節(jié)性T細胞。細胞經(jīng)分選后，CD4+CD25－效應性T細胞和CD4+CD25+調節(jié)性T細胞純度均可達90%以上(Fig 1C、D)，進行后續(xù)實驗。

2.2 FP對Treg細胞抑制功能的影響 結果表明，F(xiàn)P多肽本身對Teff細胞增殖具有抑制作用。Treg:Teff(1∶2)共培養(yǎng)時，Treg能夠明顯抑制Teff細胞的增殖，抑制率約為35.2%;而在FP 25 mg·L－1存在的情況下，Treg對Teff增殖的抑制降低，抑制率約為27.0%(Fig 1)。FP對照多肽無影響。

Fig 1 Foxp3 expression of CD4+CD25+regulatory T cells and purity test of Teff and Treg

*P＜0.05 vs OVA stimulated Teff group;#P＜0.05 vs OVA+FP25 treated stimulated Teff+Teff group

2.3 FP對OVA激活的Treg細胞IL-10表達的影響 在Treg與APC共培養(yǎng)的情況下，10 μg·L－1和100 μg·L－1OVA能劑量依賴性刺激Treg分泌IL-10。FP 在25 mg·L－1的濃度時能明顯抑制 100 μg·L－1OVA刺激的IL-10表達。FP對照多肽無作用(Fig 3)。

Fig 3 Effects of FP on IL-10 production in OVA activated Treg

2.4 FP在活化的Treg細胞表面能與TCR重疊OVA刺激后，在活化的OVA Tg小鼠分離的Treg細胞表面，TCR熒光呈半月形，F(xiàn)P和TCR分布一致，出現(xiàn)熒光的重疊，而在非活化細胞綠色熒光呈圓環(huán)型，表面未見紅色熒光(Fig 4)。由于已知FP和TCR跨膜區(qū)能夠互相結合［6］，結果提示FP與TCR信號的重疊可能產(chǎn)生相互作用，從而影響APC向Treg遞呈信號、干擾Treg活化。

3 討論

HIV gp41融合多肽是啟動病毒感染的重要多肽。HIV包膜蛋白gp120與靶細胞上CD4受體和輔助受體結合后，跨膜亞基gp41暴露出來，位于其N末端的FP可以插入靶細胞膜，啟動N-端和C-端螺旋重復序列形成六聚體，拉近病毒和靶細胞膜的距離發(fā)生融合，從而使病毒基因組進入并感染宿主細胞［5］。

HIV主要感染CD4+的T淋巴細胞，它與宿主免疫細胞的相互作用是影響疾病發(fā)展的重要因素，也是影響疫苗成功的基礎因素。近年有報道，F(xiàn)P能抑制抗原特異性的CD4+T細胞活化，并緩解抗原誘導的關節(jié)炎。FP對T細胞活化的作用是TCR依賴性的:它可以插入人和小鼠CD4+T細胞膜，與TCR的跨膜區(qū)結合，可能通過影響TCR、CD3分子的對話(cross-talk)發(fā)揮抑制作用。FP不影響抗原呈遞細胞的功能，對非抗原特異性的包被抗CD3抗體或PMA/inomycin刺激的T細胞活化(兩個系統(tǒng)均不依賴APC)無影響。因此，F(xiàn)P在插入靶細胞膜的時候，可能同時抑制了CD4+T細胞對HIV病毒抗原特異性的免疫應答［6］。占CD4+T細胞5% ～10%的調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+，Treg)與HIV的感染和進展關系密切［12］，Treg活化也離不開TCR［7－8］，但是未知 FP 能否因此抑制抗原特異性的Treg活化。

Fig 4 Colocalization of FP and TCR on activated Treg cells

我們研究發(fā)現(xiàn)FP在體外能減低抗原活化后Treg細胞的免疫抑制功能和IL-10分泌。由于Treg激活后可以通過細胞間直接接觸或通過分泌IL-10、TGF-β等細胞因子對局部免疫產(chǎn)生抑制作用，提示FP減低Treg的抑制功能可能與降低IL-10的分泌有關［14］。另外，熒光共聚焦結果顯示FP能插入OVA活化的Treg細胞表面，與TCR分布一致。由于TCR介導Treg的活化［15］，Treg的激活通常也需要經(jīng)過TCR和輔助信號刺激［7－8］，提示 FP也可能通過與TCR結合影響APC遞呈信號給TCR，從而抑制抗原刺激的Treg細胞活化和功能。

在HIV感染時，F(xiàn)P能插入Treg細胞膜，導致可能因此影響Treg功能和免疫應答，尤其是在Treg增多的情況下。由于在HIV感染的早期，淋巴結中存在病毒抗原特異性的Treg細胞活化;在不能良好控制病毒復制的HIV陽性感染者(Non-controllers)的腸道中存在升高的Treg細胞［13］，F(xiàn)P對Treg的影響可能影響病毒感染的進程。Treg對HIV感染的影響可概括為好和壞兩方面［3］:好的一面是Treg及其功能蛋白Foxp3能夠抑制HIV病毒復制(HIV主要感染活化的細胞，并在活化的細胞內復制，而Treg抑制CD4效應T細胞活化)，有助于控制慢性免疫激活和激活造成的T細胞死亡、免疫系統(tǒng)崩潰;壞的一面是Treg可抑制機體對HIV的免疫應答和清除，易于造成病毒的持續(xù)感染。

綜上，HIV融合多肽能插入活化的Treg細胞表面，減弱抗原特異性的小鼠Treg細胞活化;FP對抗原特異性Treg細胞的影響，可能改變病毒和機體免疫細胞之間感染和抗感染力量的對比，影響艾滋病的疾病進展和疫苗免疫。

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