羊藿三七提取物中主成分淫羊藿苷的腸吸收研究

吳青青， 陳 彥， 蔡 垠， 賈曉斌

(江蘇省中醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇南京210028)

組分配伍中藥中有效組分的生物藥劑學特性是影響創(chuàng)新中藥口服吸收及其生物利用度的關鍵環(huán)節(jié)［1-2］。而以往創(chuàng)新中藥的研發(fā)較重視活性組分的提取純化及制劑工藝成型等過程，較少關注提取物的生物藥劑學特性?！皬头窖蜣饺咂笔蛰d于國家藥品標準，由藥材淫羊藿和三七組成，具有溫陽通脈，化瘀止痛之功效［3］，但其活性組分的生物藥劑學特性不詳，影響了其深度開發(fā)與療效的發(fā)揮。因此本研究選擇羊藿三七復方為模型藥物，采用Caco-2細胞模型，考察羊藿三七提取物中主成分淫羊藿苷的腸吸收轉運情況并與淫羊藿提取物及單體淫羊藿苷比較，為中藥組分尤其是難溶性組分與低膜滲透性組分的適宜劑型的設計提供科學依據。

1 材料

Caco-2 TC7細胞株 (由法國 Moniqué Rousset博士饋贈);非必需氨基酸 (JRH公司);谷氨酰胺、胰蛋白酶 (Sigma公司);胎牛血清 (Equitech-Bio，INC公司);DMEM培養(yǎng)基 (Hyclone公司);淫羊藿苷 (批號110737-200312，供定量測定用)購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

三七藥材購于同濟藥業(yè)有限公司，產地:云南;淫羊藿藥材，購自吉林敦化，經南京中醫(yī)藥大學吳德康教授鑒定分別為朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai和三七Panax notoginseng。

二氧化碳培養(yǎng)箱 (Nuaire，美國);XDS—1B倒置顯微鏡 (重慶);高速冷凍離心機 (Allergra X-22R，Beckman， 美 國);Transwell培 養(yǎng) 板(NUNC，丹麥);Millicell—ERS跨膜電阻儀 (Millipore，美國);Agilent 1200型高效液相色譜儀(Agilent，美國);Milli—Q純水機 (Millipore，美國)。

1.1 羊藿三七提取物及淫羊藿提取物的制備 羊藿三七提取物制備:稱取處方量淫羊藿600 g，加水煎煮2次，第1次2 h，第2次1 h，合并煎液，濾過;稱取三七粗粉200 g，加水煎煮3次，第1次3 h，第2次2 h，第3次1 h，合并煎液，濾過，濾液與淫羊藿濾液合并，減壓濃縮成相對密度為1.30～1.35(80～85℃)的稠膏，干燥即得羊藿三七提取物。

淫羊藿提取物制備:稱取淫羊藿600 g，加水煎煮2次，第1次2 h，第2次1 h，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮 (80～85℃)成稠膏，干燥即得淫羊藿提取物。

1.2 不同樣品淫羊藿苷的跨膜轉運實驗

1.2.1 樣品溶液的配制 淫羊藿苷溶液配制:精密稱取淫羊藿苷3.38 mg，將其溶解于500 μL DMSO-無水乙醇溶液中，精密吸取該溶液100 μL置50 mL量瓶中，用 Hank's平衡鹽溶液 (HBSS溶液)溶解定容，配制成含淫羊藿苷 20 μmol/L的溶液。

羊藿三七提取物溶液配制:精密稱取羊藿三七提取物132.0 mg，按“淫羊藿苷溶液配制”方法，將其配制成含淫羊藿苷20 μmol/L的溶液。

淫羊藿提取物溶液配制:精密稱取淫羊藿提取物101.3 mg，按“淫羊藿苷溶液配制”方法，將其配制成含淫羊藿苷20 μmol/L的溶液。

睪丸酮內標溶液配制:精密稱取睪丸酮14.4 mg，加乙腈溶解定容至5 mL，配制成質量濃度為10 μmol/L的貯備液。精密吸取該貯備液0.1 mL，加入9.4 mL乙腈與0.6 mL冰乙酸，混合均勻，即得含睪丸酮100 μmol/L的內標溶液。

1.2.2 轉運實驗［4-5］Caco-2細胞培養(yǎng)于 DMEM培養(yǎng)液，其中含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺和青霉素 (100 U/mL)-鏈霉素(100 μg/mL)雙抗液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)19～21 d可用于實驗。

轉運實驗前，先用37℃ pH 7.4的HBSS溶液將細胞單層洗滌3次，檢測各孔跨膜電阻值大于100 Ω/4.2 cm2以上，方可用于實驗。將已配置的藥物溶液分別加在細胞絨毛面頂側 (AP側)或基底面?zhèn)?(BL側)，相對應的BL側或AP側加入空白HBSS溶液，體積分別為2 mL。將加完藥和空白HBSS溶液的培養(yǎng)板置于恒溫搖床中 (50 r/min，37℃)，分別在1，2，3、4 h在細胞供給池或接收池取樣400 μL，同時在細胞供給或接收側補充等體積的藥物溶液或HBSS溶液。試驗平行做3份。

1.2.3 樣品處理 將所取樣品立刻加入100 μL的睪丸酮 (100 μmol/L)內標溶液，13000 r/min離心15 min，按照HPLC分析方法進行檢測。

1.2.4 高效液相樣品分析 ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為乙腈-水，梯度洗脫:0～15 min，乙腈10% ～25%;15～38 min，乙腈25%;38～61 min，乙腈25% ～71%;61～70 min，乙腈71%;體積流量1 mL/min，檢測波長268 nm;柱溫為30℃。HPLC圖譜見圖1。

圖1 淫羊藿苷 (A)、淫羊藿提取物 (B)和羊藿三七提取物 (C)Caco-2細胞實驗轉運4 h HPLC圖(BL-AP)Fig.1 HPLC chromatography of 4h Caco-2 cell transport sample(BL-AP)of icariin(A)，extract of Epimedii Herba(B)and extract of Yanghuo Sanqi Tablats(C)

1.2.5 數(shù)據分析［6］藥物透過Caco-2細胞單層的能力以表觀滲透系數(shù)Papp值為考察指標，其計算公式:Papp=(dQ/dt)/SC

其中dQ/dt為接收池待測藥物濃度變化的表觀線性速率，S為Caco-2細胞膜表面積 (4.2 cm2)，C為藥物的初始濃度。用Excel表對實驗數(shù)據進行計算分析。

2 結果

20 μmol/L淫羊藿苷及含有20 μmol/L淫羊藿苷的復方羊藿三七提取物及淫羊藿提取物通過Caco-2細胞單層轉運的滲透系數(shù)測定結果見表1。實驗結果表明，在淫羊藿苷濃度相同的條件下，羊藿三七提取物及淫羊藿提取物中淫羊藿苷的吸收滲透系數(shù)均較小，且略小于單體，但無顯著性差異，而分泌滲透系數(shù)與單體相比較均有顯著性降低的趨勢，整體外排比率下降了1倍左右。各樣品中淫羊藿苷的雙向轉運量隨時間的變化見圖2。實驗結果表明，各樣品中淫羊藿苷雙向轉運量在4 h內都隨著時間的增加而呈線性增長趨勢。

表1 淫羊藿苷表觀滲透系數(shù)測定結果(±s，n=3)Tab.1 The Pappof icariin(±s，n=3)

表1 淫羊藿苷表觀滲透系數(shù)測定結果(±s，n=3)Tab.1 The Pappof icariin(±s，n=3)

注:與淫羊藿單體比較，*P＜0.05。

樣 品Papp/(×10－6cm·s－1)AP-BL BL-AP PBA/PAB羊藿三七提取物 0.52±0.034 1.28±0.043*2.46淫羊藿提取物 0.55±0.014 1.26±0.012* 2.29單體淫羊藿苷0.62±0.032 3.00±0.22 4.83

圖2 淫羊藿苷1～4 h跨膜轉運量Fig.2 Transport of icariin during 1－4 h

4 討論

本研究采用Caco-2細胞模型，考察了羊藿三七提取物中主成分淫羊藿苷的腸吸收轉運情況并與淫羊藿提取物及單體淫羊藿苷比較。課題組在前期研究中對單體淫羊藿苷的生物藥劑學特性如溶解性、膜滲透性、穩(wěn)定性、吸收代謝特性等進行了深入的研究［7-12］，結果表明單體淫羊藿苷吸收較差，其機制除與其單純的膜滲透性較差外，還可能存在著小腸上皮細胞中P-gp轉運蛋白的外排作用。對淫羊藿苷生物藥劑學特性的深入研究，有利于對以淫羊藿苷為主要活性成分的中藥劑型的設計提供科學依據。

中藥多以提取物或復方制劑應用，但對中藥及復方提取物中活性成分或組分的生物藥劑學特性的研究目前還比較薄弱，中藥及復方提取物中活性成分由于與其它成分共存，其吸收代謝可能與單體化合物不同而更加復雜，因此不能以單體化合物的特性簡單替代提取物中的情況。本研究的實驗結果亦表明，羊藿三七提取物及淫羊藿提取物中所含淫羊藿苷的吸收滲透系數(shù)雖與淫羊藿苷單體相差較小，但分泌滲透系數(shù)卻顯著降低，外排比率降低了1倍左右，表明提取物中所含的其它成分可能對外排泵產生競爭抑制作用，抑制了淫羊藿苷的外排，從而有利于淫羊藿苷的吸收。由于羊藿三七提取物及淫羊藿提取物中淫羊藿苷的吸收滲透系數(shù)與分泌滲透系數(shù)相近，因此推測外排比率的下降主要與淫羊藿中所含的其它成分影響相關。然而，盡管淫羊藿中其他成分對淫羊藿苷具有促吸收作用，但與其它吸收較好的藥物相比，其本身的理化性質仍然決定了其較差的胃腸道吸收特性。因此若以常規(guī)劑型制備以淫羊藿苷為主要成分的中藥或復方制劑，有可能因為淫羊藿苷較差的腸道吸收導致其生物利用度較低，不利于其藥理作用的發(fā)揮。因而在研制以淫羊藿為主藥的中藥制劑時，應采用能促進淫羊藿苷等成分吸收的新劑型 (如微丸、納米制劑等)或添加促吸收的輔料 (如去氧膽酸鈉、維生素E-聚乙二醇-琥珀酸酯等)進一步促進吸收，從而提高生物利用度，充分發(fā)揮其藥理作用的目的。

對中藥及復方提取物中活性成分、組分生物藥劑學特性的深入了解，有利于將其設計成適宜的劑型，克服中藥活性成分、組分生物藥劑學特性的缺陷，提高其生物利用度，從而提高創(chuàng)新中藥的研制水平。

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