HPLC-DAD-MS/MS用于養(yǎng)血清腦顆粒蒽醌類成分分析

郝曉霞， 靳元鵬， 軋 霽， 張?zhí)m蘭， 周水平， 郭治昕*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.天津天士力制藥股份有限公司，天津300410)

養(yǎng)血清腦顆粒是由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)的一種復(fù)方中藥，以川芎、當(dāng)歸為君藥，由十一味中藥采用現(xiàn)代化制劑工藝精制而成。養(yǎng)血清腦顆?？梢愿纳栖浤X膜微循環(huán)，增加腦血流量，緩解血管痙攣與止痛，具有養(yǎng)血平肝、活血通絡(luò)之功效［1］。決明子是養(yǎng)血清腦顆粒中的重要藥味之一［2］，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，決明子中蒽醌類成分具有降血壓、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等功效［3-5］。我們對(duì)養(yǎng)血清腦顆粒中的蒽醌類成分進(jìn)行富集，并對(duì)目標(biāo)部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析與研究。以蒽醌部位為研究對(duì)象，與養(yǎng)血清腦顆粒整體為研究對(duì)象相比，可以更好的富集其中的起效成分，不僅為養(yǎng)血清腦顆粒治療偏頭痛與高血壓提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，而且為其質(zhì)量控制提供了支持。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀及Agilent 1200 HPLC-6310 ION Trap Mass液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(法國(guó) Millipore公司);乙腈(色譜級(jí)，美國(guó)Merck公司)。

蘆薈大黃素(批號(hào):110795-200806)、大黃素(批號(hào):110756-200110)、大 黃 酚 (批 號(hào):110796-200615)、橙黃決明素(批號(hào):111900-201001)對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。養(yǎng)血清腦顆粒浸膏由天津天士力制藥股份有限公司提供(浸膏批號(hào):20100907)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

液相條件:色譜柱為Phenomenex C18(250 mm×4.60 mm，Gemini 5 μm);流動(dòng)相 A 為乙腈，流動(dòng)相B為0.5%的甲酸-水，梯度洗脫見表1。體積流量為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm，190 ～500 nm全波長(zhǎng)掃描，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件:檢測(cè)模式為電噴霧離子化(ESI)方式，檢測(cè)離子為正、負(fù)離子，掃描范圍100～1000 m/z，干燥氣的流量為8 L/min，干燥氣的溫度為350℃，霧化氣的壓力為241 kPa。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Procedure of gradient elution of mobile phase

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取上述對(duì)照品(橙黃決明素5.1 mg，蘆薈大黃素 2.85 mg，大黃素5.01 mg，大黃酚 4.18 mg)置于 100 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液既得對(duì)照品溶液［6］。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取未加入輔料的養(yǎng)血清腦顆粒浸膏100 g，用20%的乙醇溶解，以D101大孔樹脂柱層析分離，用20%乙醇(5 BV)、95%乙醇(5 BV)分別洗脫，收集95%乙醇洗脫液，將目標(biāo)物富集。將95%乙醇洗脫液濃縮至糊狀，用30%乙醇溶液溶解，以100～200目的聚酰胺柱層析分離，30%乙醇(5 BV)、95%乙醇(5 BV)分別洗脫。收集95%乙醇洗脫液即為目標(biāo)蒽醌部位。

2.4 HPLC-DAD-MS/MS特征峰歸屬 通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的比較可以完成對(duì)物質(zhì)的定性分析［7-9］。本實(shí)驗(yàn)以養(yǎng)血清腦顆粒為研究對(duì)象，對(duì)其中的蒽醌成分進(jìn)行分析，結(jié)合質(zhì)譜碎片信息及混合標(biāo)準(zhǔn)品的成分比較，對(duì)特征峰進(jìn)行了歸屬指認(rèn)。供試品與對(duì)照品比較圖譜見圖1，供試品溶液的液質(zhì)聯(lián)用圖譜見圖2，特征峰歸屬指認(rèn)結(jié)果見表2，部分蒽醌類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式見表3。

圖1 供試品(A)與對(duì)照品(B)HPLC比較圖譜1.橙黃決明素 2.蘆薈大黃素 3.大黃素 4.大黃酚Fig.1 HPLC chromatograms of sample(A)and mixed standard(B)1.aurantio-obtusin 2.aloeemodin 3.emodin 4.chrysophanol

圖2 養(yǎng)血清腦顆粒蒽醌部位LC-MS/MS聯(lián)用圖譜Fig.2 LC-MS/MS chromatograms of anthraquinones in Yangxue Qingnao GranuleA.ESI(+MS)B.ESI(-MS)C.ESI(+MSn)D.ESI(-MSn)E.HPLC-UV

表2 養(yǎng)血清腦顆粒中蒽醌類成分特征峰歸屬Tab.2 Results of LC-MS/MS analysis of anthraquinones in Yangxue Qingnao Granule

色譜峰 1，通過 m/z 902.8［M+H］+及 939.4［M+Cl］－共同判斷該物質(zhì)分子量為902，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［10］及藥味歸屬，判斷該物質(zhì)可能為決明子藥味中的大黃酚-四吡喃葡萄糖苷(chrysophanol-tetra-β-D-glucopyranoside)。色譜峰2，通過 m/z 331.0［M+H］+可推知該化合物的分子量為330，兩個(gè)碎片離子峰 315.6 ［M-CH3］+及 297.6［M-CH3-H2O］+可能通過如圖3所示途徑分裂而來。初步推測(cè)其可能為橙黃決明素(aurantio-obtusin)或 3-甲基-1，2，8-三羥基-6，7-二甲氧基蒽醌(1，2，8-trihydroxy-6，7-dimethoxy-3-methylanthraquinone)［2］，這兩種成分為同分異構(gòu)體，難以通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒別，而在相同的色譜條件下，橙黃決明素(aurantio-obtusin)標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液中該物質(zhì)保留時(shí)間相同，最終判斷該物質(zhì)可能為決明子藥味中的橙黃決明素(aurantio-obtusin)［11］。色譜峰 5，通過 m/z 359.7 ［M+H］+推測(cè)它的分子量為358，而其他質(zhì)譜碎片離子峰325.8［M-CH3-H2O］+、310.6［M-2CH3-H2O］+的結(jié)構(gòu)推導(dǎo)如圖4。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［10］及藥味歸屬，該物質(zhì)可能為決明子中的 3-甲基-2-羥基-1，6，7，8-四甲氧基蒽醌 (2-hydroxy-1，6，7，8-tetramethoxy-3-methylanthraquinone)。色譜峰6，通過m/z367.4［M+Na］+推測(cè)其分子量為344，307.1［M-2H2O］+可能為3-甲基-2，8-二羥基-1，6，7-三甲氧基蒽醌(2，8-dihydroxy-1，6，7-trimethoxy-3-methyl anthraquinone)脫掉兩分子水所得，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及藥味歸屬，推測(cè)其可能為 3-甲基-2，8-二羥基-1，6，7-三甲氧基蒽醌(2，8-dihydroxy-1，6，7-trimethoxy-3-methylanthraquinone)［2］。蘆薈大黃素 (aloeemodin)、大黃酸(rhein)、大黃素(emodin)、大黃酚(chrysophanol)［13］質(zhì)譜碎片離子峰分析如表2，且供試品與混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在相同的色譜條件下對(duì)應(yīng)物質(zhì)保留時(shí)間一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了結(jié)構(gòu)推測(cè)的準(zhǔn)確性。

表3 部分蒽醌類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Tab.3 Chemical structures of anthraquinones in Yangxue Qingnao Granule

2.5 特征成分的定量測(cè)定 已鑒定成分中，目前有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)為橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素及大黃酚，但是在目前的色譜條件下，大黃酸及大黃酚達(dá)不到定量測(cè)定分離度的要求，因此對(duì)已鑒定成分中的橙黃決明素、蘆薈大黃素及大黃素3個(gè)物質(zhì)定量測(cè)定。

2.5.1 線性關(guān)系考察 吸取適量2.2項(xiàng)的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣體積(μL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。線性回歸方程:橙黃決明素 Y=21.117X+1.4833，r2=0.9998，線性范圍為0.05 ～ 0.5 μg;蘆薈大黃素 Y=113.45X+9.6952，r2=0.9998，線性范圍為 0.03 ～ 0.3 μg;大黃素 Y=128.77X+7.5976，r2=0.9999，線性范圍為 0.05 ～0.5 μg。結(jié)果表明，橙黃決明素、蘆薈大黃素及大黃素在一定的線性范圍內(nèi)均有良好的線性。

圖3 化合物2(橙黃決明素)的主要碎裂途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathways of aurantio-obtusin

圖4 化合物5(3-甲基-2-羥基-1，6，7，8-四甲氧基蒽醌)的主要碎裂途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathways of 3-methyl-2-hydroxyl-1，6，7，8-tetramethoxy-anthraquinone

2.5.2 樣品測(cè)定 精密稱取蒽醌部位720 mg，置于25 mL的量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，進(jìn)樣10 μL。以外標(biāo)法計(jì)算目標(biāo)蒽醌部位中的橙黃決明素、蘆薈大黃素及大黃素的量，結(jié)果顯示3種蒽醌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為:橙黃決明素15.76 mg/g，蘆薈大黃素 0.40 mg/g，大黃素 1.37 mg/g。

2.5.3 加樣回收率 精密稱取蒽醌部位360 mg，分別加入相應(yīng)量的對(duì)照品貯備液，測(cè)定回收率，平行6份。計(jì)算加樣回收率，橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素的加樣回收率分別為 98.6%，99.2%，102.5%，RSD 分別為 3.1%，2.6%，4.2%。

3 討論

3.1 蒽醌部位制備方法的選擇 養(yǎng)血清腦顆粒由十一味中藥組方而成，成分復(fù)雜，而蒽醌類成分為養(yǎng)血中藥決明子的主要藥效成分。郝延軍等［12］以決明子為研究對(duì)象，通過不同吸附樹脂的比較，最終發(fā)現(xiàn)聚酰胺對(duì)決明子中的蒽醌物質(zhì)富集效果最好，這種分離方法同時(shí)可以避免有毒有害有機(jī)試劑(如三氯甲烷等)的使用。養(yǎng)血清腦中蒽醌類成分極性較小，本實(shí)驗(yàn)先通過D101大孔樹脂進(jìn)行初步富集，除去大極性的干擾物質(zhì)，而可能的藥效成分則進(jìn)一步通過聚酰胺柱層析得到，兩種填料的結(jié)合使用可以更好的減少大極性物質(zhì)的干擾，更加有效的富集蒽醌部位。

3.2 液相色譜條件的優(yōu)化 選用了3根不同廠家的色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較分離度、峰形與柱效，最終確定為Phenomenex C18(250 mm×4.60 mm，Gemini 5 μm)液相色譜柱。考察了不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，最終確定以乙腈－0.5%甲酸為流動(dòng)相較為適宜。以獲得最多的峰信息為基準(zhǔn)考察，通過DAD選擇最佳吸收波長(zhǎng)，最終確定蒽醌部位最佳吸收波長(zhǎng)為254 nm。

HPLC-DAD-MS/MS分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑分析，結(jié)合分子量與碎片離子的雙重信息，可以對(duì)復(fù)方中的化學(xué)成分進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定。這種分析方法準(zhǔn)確性較高，對(duì)某些同分異構(gòu)體也可以得到很好的分析。本實(shí)驗(yàn)首先通過有效的分離手段把養(yǎng)血清腦顆粒中的目標(biāo)蒽醌進(jìn)行富集，然后對(duì)此目標(biāo)部位進(jìn)行分析，最終確定了養(yǎng)血清腦顆粒中的8個(gè)蒽醌類特征成分。

3.3 部分特征峰的指認(rèn) 由HPLC-MS數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)報(bào)道［10］，初步推測(cè)1號(hào)峰可能為大黃酚-四吡喃葡萄糖苷。實(shí)驗(yàn)中由于標(biāo)準(zhǔn)品的缺失，該特征峰的鑒定準(zhǔn)確性有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

決明子具有較好的降血脂、降血壓、抗氧化、抗衰老等療效［13］，是養(yǎng)血清腦顆粒中非常重要的一味佐藥。其中蒽醌類成分是決明子主要的藥效成分［13］，因而深入研究養(yǎng)血清腦顆粒中的蒽醌類成分對(duì)養(yǎng)血清腦顆粒的質(zhì)量控制及藥理藥效研究均具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)通過富集、分析養(yǎng)血清腦顆粒中的蒽醌類成分，推測(cè)養(yǎng)血清腦顆?？赡艿乃幮С煞郑瑸檫M(jìn)一步的藥理實(shí)驗(yàn)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。養(yǎng)血清腦顆粒中的蒽醌類及其他成分分析、對(duì)養(yǎng)血清腦顆粒治療高血壓與偏頭痛的研究也正在開展中，深入工作將會(huì)在后續(xù)文章中報(bào)道。

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