熱蒸汽—雙氧水法制備人類(lèi)G顯帶染色體的研究①

黃正思,陸潔萍,韋玉琛,馮治

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院2008級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科1班,廣西 百色 533000 E-mail:si110520@163.com;2.右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,廣西 百色 533000)

染色體顯帶技術(shù),目前已廣泛應(yīng)用于染色體病及癌癥方面的研究,是人類(lèi)遺傳學(xué)研究和臨床細(xì)胞遺傳學(xué)診斷的重要手段,能否在短時(shí)間內(nèi)獲取分散良好、顯帶清晰的染色體是加快染色體疾病診斷的關(guān)鍵。目前常規(guī)[1]的染色體G顯帶技術(shù),常采用冰片滴片,新制的染色體標(biāo)本需經(jīng)自然老化或高溫烘干后才能行G顯帶處理。常規(guī)法制備的染色體G顯帶標(biāo)本質(zhì)量常與操作者的經(jīng)驗(yàn)有關(guān),若經(jīng)驗(yàn)不足,則有時(shí)造成染色體分散不良,不利于觀察,給臨床染色體病的檢查帶來(lái)困難,且烘干時(shí)間較長(zhǎng),在臨床檢測(cè)中也給來(lái)診人員造成不便。針對(duì)上述情況,我們擬采用熱蒸汽—雙氧水法[2]制備染色體G顯帶標(biāo)本,此法可改善染色體的分散度,縮短老化時(shí)間,且顯帶良好,易于掌握,重復(fù)性好,有效解決了以上問(wèn)題。現(xiàn)報(bào)道如下:

1 資料和方法

1.1 試劑 RPMI640(Gibco公司),植物細(xì)胞凝集素(PHA上海伊華公司),胎牛血清(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所),秋水仙素(美國(guó) Sigma公司)和Giemsa原液,0.025%胰蛋白酶液(Sigma進(jìn)口分裝),甲醇、冰乙酸0.075mol/L KCl及常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)及制片耗材等。

1.2 制備方法 取25例正常人靜脈血0.5ml進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),每例做2份,1份為對(duì)照組,1份為實(shí)驗(yàn)組,按下列步驟進(jìn)行:

1.2.1 細(xì)胞收獲和低滲 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,均按常規(guī)培養(yǎng)72h后,將細(xì)胞培養(yǎng)物移入5ml離心管,以轉(zhuǎn)速1500r/min離心8min,收集細(xì)胞。加入預(yù)溫的0.075mol/L KCl溶液4ml,37℃水浴低滲22min。

1.2.2 固定 在離心前加入3∶1甲醇冰醋酸固定液1ml進(jìn)行預(yù)固定,以轉(zhuǎn)速 1500r/min離心 8min,去上清液加入3∶1甲醇冰醋酸固定液5ml,混勻立即離心,重復(fù)固定2次。最后一次離心后,留取0.3～0.5ml固定液,混勻。

1.2.3 滴片和老化

1.2.3.1 對(duì)照組 用冰片滴片,滴片時(shí)吸管距離載玻片25cm左右,在75℃下烘干 2～3h或自然老化2～3天。

1.2.3.2 試驗(yàn)組 將細(xì)胞懸液滴至熱玻片上(事先將載玻片平置于水浴鍋沸水的熱蒸氣上,吸管距離載玻片3～4cm),滴片后立即用30%過(guò)氧化氫老化10min,自來(lái)水徹底沖洗。

1.2.4 顯帶染色 兩組用0.025%的胰酶消化顯帶,Giemsa染色8min。

1.2.5 觀察指標(biāo) 鏡檢,每份標(biāo)本分別計(jì)數(shù)40個(gè)分裂相,試驗(yàn)組和對(duì)照組分別總記1000個(gè)分裂相,記錄兩組染色體分散優(yōu)良和差兩種情況所占的個(gè)數(shù)。染色體分散程度[3]:將早、中期染色體交叉數(shù)多少分為2級(jí),即交叉數(shù)≤3為優(yōu)良,交叉數(shù)≥4為差。觀察兩種方法的染色體顯帶情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有資料經(jīng)四方表格卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法的鏡下所見(jiàn) 鏡下可見(jiàn)用常規(guī)法制片所獲的染色體標(biāo)本分散不良(見(jiàn)圖1),而用改良方法[4]制備的外周血染色體標(biāo)本,細(xì)胞中分散及顯帶良好,長(zhǎng)度適中,標(biāo)本背景清晰(見(jiàn)圖2),標(biāo)本顯帶質(zhì)量?jī)?yōu)于或相當(dāng)于常規(guī)法。

圖1 常規(guī)法:染色體分散不良

圖2 熱蒸汽—雙氧水法染色體分散及顯帶良好

2.2 染色體分散程度的比較 將早、中期染色體按交叉數(shù)多少分成分散優(yōu)良、分散不良兩級(jí),統(tǒng)計(jì)學(xué)卡方檢驗(yàn)顯示,熱蒸汽—過(guò)氧化氫法與常規(guī)法相比,對(duì)染色體分散差異具有高度顯著性(P＜0.01),試驗(yàn)組 1000個(gè)分裂相有672個(gè)分散優(yōu)良,占67.20%,對(duì)照組1000個(gè)分裂相有584個(gè)分散優(yōu)良,占 58.40%。因此熱蒸汽—過(guò)氧化氫法的染色體分散優(yōu)于常規(guī)法。見(jiàn)表1。

表1 兩種方法對(duì)染色體分散成度的影響

3 討論

3.1 染色體分散程度是獲得高質(zhì)量G顯帶染色體標(biāo)本的關(guān)鍵。以往采取冰片滴片,雖可使細(xì)胞較好黏附在玻片上,但滴片的高度不好掌控,高位滴片容易使細(xì)胞濺失,可能造成制片中可供分析用的染色體很少。滴片時(shí),若操作不好,使所滴細(xì)胞懸液重疊,會(huì)造成細(xì)胞分裂重疊相而影響染色體分散效果。實(shí)驗(yàn)組改用熱滴片法則能改善上述情況,即明顯改進(jìn)了染色體的分散鋪展程度,降低重疊率,而且細(xì)胞染色體不易丟失,分裂相形態(tài)完整,更便于染色體顯帶觀察。

3.2 常規(guī)法滴片后,新鮮的染色體標(biāo)本需經(jīng)自然老化三天或75℃高溫2～3h烘干老化,使蛋白質(zhì)變性,才能進(jìn)行G顯帶處理染色體標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)用30%過(guò)氧化氫對(duì)新鮮的染色體標(biāo)本老化處理10min后,可立即進(jìn)行染色體G顯帶制備,顯帶效果與常規(guī)法相當(dāng),甚至有部分染色體帶紋優(yōu)于常規(guī)法。過(guò)氧化氫是一種每個(gè)水分子里含兩個(gè)氧原子的液體,具有較強(qiáng)的滲透性和氧化作用,可以使蛋白質(zhì)變性,因此用30%的高濃度的過(guò)氧化氫可大大縮短細(xì)胞老化時(shí)間。

3.3 本實(shí)驗(yàn)采用過(guò)氧化氫溶液來(lái)老化處理標(biāo)本后立即用胰蛋白酶消化顯帶,不僅帶型清晰,染色體G顯帶成功率達(dá)100%。此法縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間,能及時(shí)滿(mǎn)足臨床診斷需求,為患者提供方便,且不需昂貴試劑,操作簡(jiǎn)單,易于把握,重復(fù)性好,適于臨床檢測(cè),可推廣,進(jìn)而促進(jìn)染色體顯帶技術(shù)的發(fā)展。另一方面,此改進(jìn)的滴片高度、細(xì)胞過(guò)氧化氫老化方法,學(xué)生易于把握,重復(fù)性好,可應(yīng)用于教學(xué)。

[1]黃修海,單長(zhǎng)民.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:科學(xué)出版社,2008:27-33.

[2]馮治,黃元河.外周血高分辨染色體制備方法研究[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,10(15):1139-1141.

[3]肖桂芝,馮立新,王彩鳳.用低溫誘導(dǎo)法制備人高分辨染色體[J].生物學(xué)雜志,2000(12):17.

[4]馮治.改良的外周血染色體制備技術(shù)[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2010,28(4):319.