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      中華真地鱉抗腫瘤蛋白純化、鑒定及活性研究

      2012-07-21 07:45:16王鳳霞吉愛國
      中國生化藥物雜志 2012年5期
      關(guān)鍵詞:土鱉蟲陰離子細胞株

      王鳳霞,劉 明,王 惠,劉 格,吉愛國

      (1.山東大學藥學院,山東 濟南 250012;2.中國科學院海洋研究所,山東 青島 266071;3.山東省科學院生物研究所,山東 濟南 250014)

      中華真地鱉(Eupolyphaga sinensis Walker)俗稱土鱉子、土元等,是一種土棲的蜚蠊目(Blattodea)昆蟲,廣泛分布于全國各地,目前已實現(xiàn)大規(guī)模人工飼養(yǎng)。中華真地鱉作為一種傳統(tǒng)中藥,在我國具有悠久的藥用歷史?,F(xiàn)代研究表明中華真地鱉具有抗血栓[1]、抗腫瘤[2-3]、促進骨折愈合[4]、免疫保護[5]等十分廣泛的藥理作用。近年來,國內(nèi)學者相繼從中華真地鱉中分離得到了抗腫瘤活性組分[2-3]及溶栓活性組分[6-8]等。本研究采用現(xiàn)代生化技術(shù)從該昆蟲中分離得到了一分子質(zhì)量約為72 kD的抗腫瘤蛋白組分(EPS72),并初步探討了其體外抗腫瘤活性。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      中華真地鱉購于山東濰坊春源昆蟲食品有限公司,-20℃ 冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

      人肺癌細胞株A549、肝癌細胞株Bel-7402、宮頸癌細胞株Hela、結(jié)腸癌細胞株RKO以及胰腺癌細胞株P(guān)anc-28均購自中國科學院上海細胞庫。

      CM-Sepharose Fast Flow、DEAE-Sepharose Fast Flow、HiTrap Q-Sepharose HP 柱(1 mL)、HiTrap Butyl Sepharose HP柱(1 mL)、Superdex 75 10/300GL柱均為瑞典GE Healthcare公司產(chǎn)品;10 kD MWCO離心超濾管購于美國Millipore公司;BCA蛋白含量檢測試劑盒購于美國Pierce公司;蛋白Marker為美國Fermentas產(chǎn)品;四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素、胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品。

      QuixStand膜過濾分離系統(tǒng)以及AKTA Explorer 100快速蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(FPLC),瑞典GE Healthcare;Mini-電泳系統(tǒng),北京六一儀器廠;Elx800酶標儀,美國Bio Tek;Du650紫外/可見分光光度計,美國Beckman公司。

      1.2 中華真地鱉蛋白粗提物的制備

      取洗凈的昆蟲材料加入2 L/kg預冷的生理鹽水進行組織勻漿,4℃浸提過夜,脫脂棉過濾,4℃條件下10 000 r/min離心15 min,小心刮去上層油脂,棄沉淀。上清經(jīng)400目濾網(wǎng)過濾后,加入硫酸銨至50%飽和度,4℃靜置4 h進行鹽析,然后在4℃條件下10 000 r/min離心15 min,棄沉淀。上清液繼續(xù)加入硫酸銨至80%飽和度,置4℃冰箱4 h,同樣條件下再次離心,棄上清,收集沉淀,用適量水溶解沉淀。將溶解后的硫酸銨分級沉淀部分先用QuixStand膜過濾分析系統(tǒng)進行微濾,濾出液用UFP-10-C-4MA膜組件(截留分子質(zhì)量為10 kD)進行超濾去除小分子并脫鹽,大于10 kD組分經(jīng)冷凍干燥后即得到蛋白粗提物。

      1.3 抗腫瘤活性成分的色譜分離與純化

      1.3.1 CM-Sepharose Fast Flow 陽離子交換色譜取一定量的蛋白粗提物溶于緩沖液A(50 mmol/L乙酸緩沖液,pH 5.5),將樣品上樣于預先用緩沖液A平衡的CM-Sepharose FF陽離子交換柱(2.6 cm×10 cm),流速為10 mL/min。上樣后柱子先用緩沖液A沖洗5個柱體積洗脫未充分結(jié)合的蛋白,結(jié)合的蛋白先后用0.15和1.0 mol/L NaCl溶液(溶于緩沖液A中)洗脫2個柱體積。整個色譜過程采用280 nm檢測蛋白質(zhì)洗脫情況,分別收集各洗脫峰,采用活性跟蹤法確定活性組分。

      1.3.2 DEAE-Sepharose Fast Flow 陰離子交換色譜

      取1.3.1項下得到的活性組分采用離心超濾(10 kD超濾管)的方法轉(zhuǎn)到緩沖液B(20 mmol/L Tris-HCl緩沖液,pH 8.0)后上樣于用緩沖液B平衡的陰離子交換柱DEAE-Sepharose FF(2.6 cm×10 cm),流速為10 mL/min。未充分結(jié)合的蛋白先用緩沖液B 洗5 個柱體積,結(jié)合的蛋白先后用 0.1,0.2,0.3和1.0 mol/L NaCl溶液(溶于緩沖液B中)洗脫2個柱體積。收集活性峰。

      1.3.3 Q-Sepharose High Performance 陰離子交換色譜 將1.3.2項下的活性組分采用離心超濾的方法轉(zhuǎn)到緩沖液C(50 mmol/L磷酸緩沖液,pH 7.0)后上樣于用緩沖液C平衡的HiTrap Q-Sepharose HP離子交換柱(1 mL),流速為1 mL/min。充分洗脫未結(jié)合蛋白后,結(jié)合的蛋白先用0~0.5 mol/L NaCl溶液(溶于緩沖液C)進行線性梯度洗脫,洗脫體積為20 mL,然后用1.0 mol/L NaCl溶液(溶于緩沖液C)洗脫2個柱體積。收集活性組分。

      1.3.4 Butyl Sepharose High Performance 疏水色譜

      將1.3.3項下的活性組分的pH和電導調(diào)整至與緩沖液D(含有1.0 mol/L硫酸銨的50 mmol/L磷酸緩沖液,pH 7.0)一致,上樣于用緩沖液D平衡的HiTrap Butyl Sepharose HP疏水色譜柱(1 mL),流速為1 mL/min。柱子先用緩沖液D 5 mL充分沖洗,結(jié)合的蛋白采用線性梯度的1.0~0 mol/L硫酸銨溶液(溶于50 mmol/L磷酸緩沖液,pH 7.0)進行洗脫,洗脫體積為20 mL。收集活性組分。

      1.3.5 Superdex 75凝膠過濾色譜 將1.3.4項下的活性組分進行超濾脫鹽和濃縮后,取100 μL上樣于用0.15 mol/L NaCl溶液平衡的Superdex 75 10/300GL凝膠過濾柱。用相同的洗脫液洗脫2個柱體積,洗脫流速為0.8 mL/min。收集活性峰組分,進行超濾脫鹽并濃縮后冷凍干燥備用。

      1.4 BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度

      蛋白濃度的測定采用Pierce公司的BCA Protein Assay Kit,依據(jù)說明書進行操作。

      1.5 分子質(zhì)量的測定

      純化的活性組分的純度及表觀分子質(zhì)量采用SDS-PAGE方法進行判定。參照LaemmLi方法[9]實驗,其中分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%,穩(wěn)壓操作,濃縮膠電壓為80 V,分離膠電壓為120 V。采用考馬斯亮藍R-250染色。用預染的中低分子質(zhì)量的蛋白Marker作對照,判定純化組分的純度及表觀分子質(zhì)量。同時采用MALDI-TOF質(zhì)譜儀進行分子質(zhì)量的測定。將純化的活性組分樣品凍干后,送至中國科學院上海生命科學研究院蛋白質(zhì)組學研究分析中心,進行MALDI-TOF質(zhì)譜檢測。

      1.6 細胞培養(yǎng)及MTT活性分析

      A549細胞采用 F-12K培養(yǎng)基,Bel-7402、Hela、RKO以及Panc-28細胞采用RPMI 1640培養(yǎng)基。將腫瘤細胞接種于含10%FBS、100 u/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的F-12K或RPMI 1640培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

      MTT活性分析參照Mosmann方法[10]。取對數(shù)生長期的癌細胞,用胰酶消化后調(diào)整細胞懸液的密度,以5×103個/孔的密度接種于96孔板中,每孔100 μL,在37℃條件下貼壁培養(yǎng)24 h。然后每孔加入含不同濃度純化組分的培養(yǎng)液100 μL,對照組用培養(yǎng)液代替EPS72,空白組用相應的培養(yǎng)液代替細胞懸液和EPS72,各組設3個平行孔,置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入5 mg/mL MTT溶液30 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄除孔中培養(yǎng)液,然后每孔加入DMSO 150 μL,振動15 mim以充分溶解甲瓚結(jié)晶。酶標儀檢測各孔在570 nm波長處吸光度(A)值,實驗至少重復3次。細胞抑制率 =[(A對照-A樣品)/A對照]×100%。采用 Excel分析軟件計算半數(shù)抑制濃度IC50。

      1.7 統(tǒng)計學處理

      數(shù)據(jù)使用SPSS16.0分析軟件進行處理,數(shù)據(jù)以(x±s)表示,顯著性檢驗采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結(jié)果

      2.1 CM-Sepharose FF陽離子交換色譜分離純化結(jié)果

      超濾得到的蛋白粗提物(命名為活性組分I)首先通過CM-Sepharose FF弱陽離子交換柱進行色譜分離,色譜圖見圖1。在該條件下,大部分蛋白未掛柱(C0),而用0.15 mol/L NaCl溶液洗脫時出現(xiàn)2個不能完全分開的峰(C1和C2),故將2個峰合并收集,用1.0 mol/L NaCl溶洗脫出1個較小的峰(C3)。分別收集上述3個組分,超濾脫鹽并凍干后進行MTT體外抗腫瘤活性檢測,細胞株為人肝癌細胞Bel-7402。結(jié)果發(fā)現(xiàn),0.15 mol/L NaCl溶液洗脫組分(即C1和C2合并組分)對Bel-7402細胞具有較強細胞毒活性,而另外2個組分(C0和C3)無明顯活性。因此,選取0.15 mol/L NaCl溶液洗脫組分(命名為活性組分Ⅱ)進行下一步實驗。從圖中可以看出,此步色譜有效捕獲了活性成分。

      圖1 中華真地鱉蛋白粗提物(活性組分Ⅰ)CM-Sepharose FF陽離子交換色譜圖譜Fig.1 CM-Sepharose FF cation exchange chromatography of E.sinensis crude protein extracts(bioactive fractionⅠ)

      2.2 DEAE-SepharoseFF陰離子交換色譜分離純化結(jié)果

      將活性組分Ⅱ通過DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱進行進一步色譜分離,分別收集圖2所示的5個峰,脫鹽凍干后進行體外抗腫瘤活性檢測。結(jié)果表明,活性組分為0.3 mol/L NaCl溶液洗脫部分(D3),選取0.3 mol/L NaCl溶液洗脫組分(命名為活性組分Ⅲ)進行下一步實驗。從圖2中可以看出,此步色譜進一步有效捕獲了活性成分。

      圖2 活性組分Ⅱ的DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜圖譜Fig.2 DEAE-Sepharose FF anion exchange chromatography of the bioactive fractionⅡ

      2.3 Q-Sepharose HP陰離子交換色譜分離純化結(jié)果

      將活性組分Ⅲ經(jīng)Q-Sepharose HP強陰離子柱進行色譜純化,色譜圖見圖3??梢苑蛛x到4個組分,其中組分Q0(未掛柱)和Q1(掛柱)含量較高,組分Q3含量較低,而Q2含量甚微。分別收集Q0、Q1和Q3等3個組分脫鹽凍干后進行活性檢測,結(jié)果表明,峰Q1為活性組分(命名為活性組分Ⅳ),收集活性組分進行下一步精制純化。

      2.4 Butyl SepharoseHP疏水色譜分離純化結(jié)果

      圖3 活性組分Ⅲ的Q-Sepharose HP陰離子交換色譜圖譜Fig.3 Q-Sepharose HP anion exchange chromatography of the bioactive fractionⅢ

      將活性組分Ⅳ經(jīng)Butyl Sepharose HP進行進一步純化,見圖4??梢苑蛛x到4個組分,其中組分B0(未掛柱)和B2(掛柱)含量較高,而組分B1和B3含量較低。分別收集這4個組分脫鹽凍干進行活性檢測,結(jié)果表明,峰B2為活性組分(命名為活性組分Ⅴ),收集活性組分進行下一步精制純化。

      圖4 活性組分Ⅳ的Butyl Sepharose HP疏水色譜圖譜Fig.4 Butyl Sepharose HP hydrophobic interaction chromatography of the bioactive fractionⅣ

      2.5 Superdex 75凝膠過濾色譜分離純化結(jié)果

      取濃縮后的活性組分V 100 μL上樣于Superdex 75 10/300GL柱進行進一步精制,色譜圖見圖5。活性組分Ⅴ經(jīng)此步色譜純化后共得到3個組分,其中峰f1含量最高,而峰f3含量甚微。分別收集f1和f2組分進行活性檢測,結(jié)果表明,峰f1為活性組分(命名為活性組分Ⅵ),收集活性組分凍干后進行純度鑒定及分子質(zhì)量分布測定。

      圖5 活性組分V的Superdex 75凝膠過濾色譜圖譜Fig.5 Superdex 75 gel filtration chromatography of the bioactive fraction V

      2.6 組分Ⅵ分子質(zhì)量測定

      SDS-PAGE測定活性組分Ⅵ的分子質(zhì)量結(jié)果見圖6?;钚越M分Ⅵ在SDS-PAGE中顯示為單一的條帶,表明其達到了電泳純。根據(jù)預染蛋白Marker的遷移位置判定其表觀分子質(zhì)量為72 kD,該結(jié)果與MALDI-TOF質(zhì)譜法分析得到的分子質(zhì)量為71 737.3的結(jié)果(圖7)接近,說明我們從中華真地鱉中純化得到的抗腫瘤活性成分是分子質(zhì)量約為72 kD的單鏈蛋白,命名為EPS72。

      圖6 純化的活性組分Ⅵ的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE pattern of the purified bioactive fractionⅥ

      圖7 純化的活性組分Ⅵ的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.7 The MALDI-TOF mass spectra of the purified bioactive fractionⅥ

      2.7 分離過程中各活性組分的體外抗腫瘤活性檢測

      采用MTT比色法對分離過程中各活性組份進行追蹤,將每步得到的活性組份用于下一步分離。純化過程中各活性組分對人肝癌Bel-7402細胞株48 h的細胞毒性(IC50)見表1。由表1可知,蛋白粗提物經(jīng)過5步色譜分離與純化后,得到抗腫瘤蛋白成分對肝癌Bel-7402細胞表現(xiàn)出較好的細胞毒性。

      2.8 EPS72對腫瘤細胞生長存活的影響

      Bel-7402、A549、Hela、RKO 及 Panc-28 細胞分別用不同濃度(5,10,20,30 和 40 μg/mL)的 EPS72處理48 h,MTT法分析其對細胞生長的影響,結(jié)果見表 2。當 EPS72濃度達到 10 μg/mL以上時,EPS72對5株腫瘤細胞均有不同程度的抑制作用,且呈明顯量效關(guān)系。顯示該活性蛋白成分具有較強的廣譜抗腫瘤活性。通過比較EPS72對各種細胞的IC50發(fā)現(xiàn),EPS72除對人胰腺癌細胞株P(guān)anc-28的IC50較高外,對人肝癌Bel-7402細胞、肺癌A549細胞、宮頸癌Hela細胞以及結(jié)腸癌RKO細胞的IC50比較接近,均在18.76 ~20.05 μg/mL 范圍內(nèi)。

      表1 純化過程中各活性組分對人肝癌Bel-7402細胞株的細胞毒性(± s,n=3)Tab.1 The cytotoxicity against Bel-7402 cells of the separate bioactive fractions from E.sinensis Walker(± s,n=3)

      表1 純化過程中各活性組分對人肝癌Bel-7402細胞株的細胞毒性(± s,n=3)Tab.1 The cytotoxicity against Bel-7402 cells of the separate bioactive fractions from E.sinensis Walker(± s,n=3)

      純化步驟 粗提物(組分Ⅰ)CM-Sepharose FF(組分Ⅱ)DEAE-Sepharose FF(組分Ⅲ)Q-Sepharose HP(組分Ⅳ)Butyl Sepharose HP(組分Ⅴ)Superdex 75(組分Ⅵ)IC50/(μg/mL)458.22 ±6.97 206.75 ±4.61 98.54 ±3.23 47.18 ±1.74 31.36 ±1.36 20.01 ±1.13

      表2 EPS72對體外培養(yǎng)A549、Bel-7402、Hela、RKO及Panc-28癌細胞48 h的抑制率(± s,n=3)Tab.2 Growth inhibitory effects of EPS72 on A549,Bel-7402,Hela,RKO and Panc-28 cells in vitro(± s,n=3)

      表2 EPS72對體外培養(yǎng)A549、Bel-7402、Hela、RKO及Panc-28癌細胞48 h的抑制率(± s,n=3)Tab.2 Growth inhibitory effects of EPS72 on A549,Bel-7402,Hela,RKO and Panc-28 cells in vitro(± s,n=3)

      與對照組比較:1P <0.05,2P <0.01 1P <0.05,2P <0.01 vs control group

      劑量(μg/mL)抑制率/%Bel-7402 A549 Hela RKO Panc-28 0(對照組)00000 5 3.82 ±2.45 4.49 ±1.77 7.08 ±2.321 6.86 ±2.741 1.03 ±3.06 10 20.47 ±3.212 18.97 ±2.882 25.72 ±2.812 21.65 ±3.072 7.04 ±2.201 20 62.68 ±1.912 63.26 ±1.862 66.59 ±1.992 62.95 ±2.362 39.06 ±2.602 30 83.84 ±2.522 84.03 ±2.452 86.17 ±1.332 85.12 ±1.802 63.82 ±2.312 40 92.17 ±1.512 91.69 ±1.692 92.83 ±2.442 94.60 ±1.422 73.81 ±1.822 IC50/(μg/mL) 20.01 ±1.13 20.05 ±0.96 18.76 ±0.84 19.39 ±0.72 26.80 ±1.35

      3 討論

      關(guān)于藥用土鱉蟲中華真地鱉的化學成分及藥理作用方面的研究進展,我們曾做過綜述[11]。本研究依次采用硫酸銨分級沉淀、超濾、CM-Sepharose FF陽離子交換色譜、DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜、Q-Sepharose HP陰離子交換色譜、Butyl Sepharose HP疏水色譜以及Superdex 75凝膠過濾色譜等蛋白質(zhì)分離純化技術(shù),以人肝癌細胞株Bel-7402作為受試細胞,通過MTT活性追蹤法,從中華真地鱉體內(nèi)分離純化出一種抗腫瘤活性蛋白成分。SDSPAGE以及MALDI-TOF質(zhì)譜結(jié)果表明,該活性成分是分子質(zhì)量約為72 kD的單鏈蛋白,命名為EPS72。韓雅莉等[3]曾從中華真地鱉中分離得到抗腫瘤糖蛋白組分,但由于他們未對獲得的組分進一步進行鑒定,我們得到的抗腫瘤成分與他們報道的是否屬于同一種物質(zhì)不得而知。據(jù)已有的文獻報道,EPS72是第一個明確確定分子質(zhì)量的抗腫瘤蛋白成分。我們曾嘗試對該成分進行氨基酸末端序列分析,但分析結(jié)果表明,由于該成分存在末端封閉現(xiàn)象,我們無法獲知其準確的N端序列。下一步將考慮采用酶解后分段測序的方法獲知其序列。

      體外抗腫瘤活性實驗表明,EPS72對人肝癌Bel-7402細胞、肺癌A549細胞、宮頸癌Hela細胞、結(jié)腸癌RKO細胞以及胰腺癌Panc-28細胞具有明顯的增殖抑制作用,并且呈明顯的量效關(guān)系。顯示該活性蛋白具有較強的廣譜抗腫瘤活性。而且,該活性蛋白對人肝癌Bel-7402細胞及肺癌A549細胞顯示較高的體外抗腫瘤活性,顯示其具有潛在的抗肝癌和肺癌作用,其抗腫瘤機制及體內(nèi)療效、安全性等方面的內(nèi)容還有待進一步研究。

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