麗格海棠‘宣言’離體再生因素的優(yōu)化

王海朋，羿德磊，段祖安，崔為正，王洪利

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院;農(nóng)業(yè)生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018)

麗格海棠(Rieger begoni)為秋海棠科秋海棠屬多年生草本盆栽花卉，冬季開花、花色豐富、花期長(zhǎng)，是目前國(guó)內(nèi)流行的年宵花卉，也是國(guó)際花卉市場(chǎng)上的暢銷盆花之一［1，2］。其種子繁殖易變異，扦插繁殖浪費(fèi)大量材料且移栽成活率較低［3］，生產(chǎn)栽培受到限制。李進(jìn)進(jìn)等［1－12］對(duì)麗格海棠組培技術(shù)做了探索和研究，取得了一些進(jìn)展，但各研究結(jié)果間存在較大差異，可重復(fù)性低，難以直接應(yīng)用與工廠化生產(chǎn)。本文旨在通過對(duì)影響麗格海棠‘宣言’葉片再生因子的研究，找到其分化繁育的最佳培養(yǎng)基，用于推動(dòng)該優(yōu)良品種種苗的繁育及其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，以便為麗格海棠其他優(yōu)良品種的研究、生產(chǎn)提供一般參照。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

材料來自于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)實(shí)驗(yàn)站。清水沖洗10 min，升汞消毒后用無菌水沖洗2～3遍為外植體。

1.2 方法

1.2.1 不同外植體對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響 取麗格海棠葉片、葉柄、花托，接種到MS+6－BA 2.0 mg· L－1+NAA 0.2 mg· L－1+蔗糖30 g· L－1中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)數(shù)和不定芽誘導(dǎo)率，確定適宜的外植體。試驗(yàn)中每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，3次重復(fù)(下同)。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響 將外植體分別接種到不同類型培養(yǎng)中(MS、B5、N6)中，附加6 －BA 2.0 mg·L－1+NAA 0.2 mg·L－1，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)數(shù)和不定芽誘導(dǎo)率，確定適宜的培養(yǎng)基。

1.2.3 不同細(xì)胞分裂素對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響 細(xì)胞分裂素對(duì)不定芽誘導(dǎo)有重要的作用，本試驗(yàn)以6 － BA 、KT、ZT(1.5、2.0 、2.5 mg· L－1)為影響因子，設(shè)計(jì)3 水平4 因素的正交試驗(yàn) L9(34)(見表 3)，分析不同細(xì)胞分裂素對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)狀況。

1.2.4 激素配比對(duì)麗格海棠不定芽增殖的影響 影響麗格海棠不定芽增殖的主要因素是激素配比，以6－ BA(1.0、1.5、2.0 mg· L－1)、NAA(0.1、0.2、0.3 mg· L－1)、IAA(0.1、0.2、0.3 mg· L－1)為影響因子，設(shè)計(jì)3水平4因素正交試驗(yàn)L9(34)，分析不同激素配比對(duì)麗格海棠不定芽增殖的影響(見表4)。取誘導(dǎo)生長(zhǎng)到2 cm左右的麗格海棠不定芽進(jìn)行接種，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)增殖狀況。

1.2.5 培養(yǎng)基成分對(duì)麗格海棠不定芽增殖的影響 培養(yǎng)基成分影響麗格海棠不定芽增殖狀況，以微量元素(1/4MS、1/2MS、MS)、大量元素(1/4MS、1/2MS、MS)、碳源(蔗糖、果糖、葡萄糖30 g· L－1)，設(shè)計(jì)3 水平4 因素正交試驗(yàn)L9(34)(見表5)，分析不同成分組合對(duì)麗格海棠不定芽增殖的影響，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)增殖狀況。

1.2.6 不同生長(zhǎng)素對(duì)麗格海棠無根苗的生根壯苗的影響 切取生長(zhǎng)高度為3 cm左右的麗格海棠無根苗，接入附加不同濃度(0.1、0.2、0.3 mg· L－1)IAA、NAA 、IBA 的 1/2MS 中，培養(yǎng) 30 d 后統(tǒng)計(jì)分析生根狀況，確定生根培養(yǎng)基。

1.2.7 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基附加瓊脂 6.5 g· L－1和糖，pH 為5.8，培養(yǎng)溫度25℃，光照時(shí)間12 h，光照強(qiáng)度2000 Lx。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法 誘導(dǎo)率=誘出不定芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%;誘出不定芽平均數(shù)=誘出不定芽總數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%;增殖倍數(shù)=誘出無根苗總數(shù)/接種無根苗總數(shù);苗分化率=分化幼苗數(shù)/接種幼苗苗總數(shù)×100%;數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用SAS 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響

把不同部位的外植體接入到培養(yǎng)基中，觀察其分化狀況，葉片膨大、出現(xiàn)不定芽時(shí)間分別為7 d、14 d，葉柄、花托平均為14 d、20 d。

表1 不同外植體對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of different explant on induction of buds

由表1可知，葉片不定芽誘導(dǎo)率最高，為96.7%。因此，葉片是麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的最佳外植體。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響

觀察接種于培養(yǎng)基MS、B5、N6中葉片不定芽誘導(dǎo)狀況可知，誘出不定芽平均數(shù)分別為20.4、17.5、15.9，其分化率在MS培養(yǎng)基中最高，為96.7%(見表2)。因此，MS是麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的最佳基本培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different basic culture on induction of buds

2.3 不同細(xì)胞分裂素對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響

對(duì)統(tǒng)計(jì)的麗格海棠不定芽誘導(dǎo)率進(jìn)行方差分析，由表3可知:6－BA對(duì)誘導(dǎo)麗格海棠葉片不定芽誘導(dǎo)率有顯著影響，KT、ZT對(duì)誘導(dǎo)麗格海棠葉片不定芽率沒有達(dá)到顯著水平。

表3 不同細(xì)胞分裂素對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different cytokinins on induction of buds

因此，6－BA(2.0 mg·L－1)是麗格海棠葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳細(xì)胞分裂素。

2.4 激素配比對(duì)麗格海棠不定芽增殖的影響

通過對(duì)麗格海棠苗分化率進(jìn)行方差分析，由表4可知:6－BA、NAA對(duì)麗格海棠葉片不定芽增殖有顯著影響，IAA對(duì)誘導(dǎo)麗格海棠葉片不定芽增殖沒有達(dá)到顯著水平。

表4 激素配比對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的影響Table 4 Effects of hormone ratio on induction of buds

因此，6－ BA 1.5 mg·L－1+NAA 0.1 mg·L－1是麗格海棠葉片不定芽增殖的最佳激素配比。

2.5 培養(yǎng)基成分對(duì)麗格海棠不定芽增殖的影響

以麗格海棠苗分化率來作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5:

表5 培養(yǎng)基成分對(duì)麗格海棠不定芽增殖的影響Table 5 Effects of construction of culture on the growth and polarization status

微量、碳源對(duì)麗格海棠葉片不定芽增殖分別達(dá)到極顯著和顯著水平，大量元素對(duì)麗格海棠葉片不定芽增殖影響不顯著。鄧肯氏檢驗(yàn)計(jì)算表明，1/2MS(微量)、MS、蔗糖(30 g·L－1)是最佳組合。

2.6 不同生長(zhǎng)素對(duì)麗格海棠無根苗的生根壯苗的影響

麗格海棠在1/2MS附加IAA、NAA、IBA的生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)30 d時(shí)生根情況見表6:

表6 不同種類的生長(zhǎng)素對(duì)麗格海棠生根的影響Table 6 Different types of concentration of auxin to rooting

由表6可以知:麗格海棠在1/2MS+IAA 0.1mg·L－1的生根培養(yǎng)基中生根率最高，可達(dá)93.3%，且苗高最高;3種生長(zhǎng)素都可誘導(dǎo)較高的生根率，IAA對(duì)根的誘導(dǎo)、根的伸長(zhǎng)優(yōu)于其他兩種生長(zhǎng)素;提高生長(zhǎng)素有利于增加生根數(shù)，但生根較細(xì)。

3 結(jié)論

影響麗格海棠不定芽誘導(dǎo)的因素是外植體、培養(yǎng)基和分裂素種類，誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基為MS+6－BA 2.0 mg·L－1+NAA 0.2 mg·L－1;增殖的主要因素是微量的多少、碳源及激素配比，不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+1/2MS(Trace element)+Sugar 30 g·L－1+6 － BA 1.5 mg·L－1+NAA 0.1 mg·L－1。本試驗(yàn)研究確定的麗格海棠不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基與不定芽增殖分化培養(yǎng)基與李進(jìn)進(jìn)、魏占才等［3－12］所報(bào)道的有一定差異，可能是麗格海棠的基因型差異和外植體不同部位等原因所致。

生根培養(yǎng)基為1/2MS+IAA 0.1 mg·L－1，適宜生長(zhǎng)素種類有更明顯的促進(jìn)生根壯苗效果。誘導(dǎo)不定根宜降低MS培養(yǎng)基離子濃度，這在許多植物組織培養(yǎng)中已見報(bào)道［13－14］，本試驗(yàn)采用1/2MS誘導(dǎo)獲得高生根率也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

果糖有利于提高增殖分化效果;蔗糖對(duì)麗格海棠不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響沒有達(dá)到顯著水平。魏占才［4］報(bào)道了蔗糖對(duì)麗格海棠生長(zhǎng)效果影響并不大，這與本試驗(yàn)結(jié)果較為一致，原因可能是由于外植體不定根誘導(dǎo)是一個(gè)能量消耗過程，需要提供一定碳源作為能量供應(yīng)［15－16］，當(dāng)光合作用所需的碳源滿足其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的臨界點(diǎn)時(shí)，糖質(zhì)量濃度的提高也不會(huì)增加光合效率。

［1］王進(jìn)茂，韓會(huì)景，梁海永，等.麗格秋海棠組培微繁的研究［J］.河北林果研究，2000，4:353－356

［2］范小峰，李師翁，田興旺.麗格海棠的組織培養(yǎng)與快速繁殖［J］.植物生理學(xué)通訊，2003，2:147

［3］李進(jìn)進(jìn).玫瑰秋海棠組織培養(yǎng)報(bào)告［J］.植物生理學(xué)通訊，1997，(5):358－359

［4］魏占才，周 鑫.麗格海棠組培苗離體生根的研究［J］.植物研究，2006，26(4):427－429

［5］孫莉莉，甄 卞，王振力，等.麗格海棠初代誘導(dǎo)技術(shù)研究［J］.北方園藝，2006(5):146－147

［6］胡燕梅，喻 捷，余群娣，等.麗格海棠葉片離體培養(yǎng)技術(shù)研究［J］.武漢生物工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，4(4):198－200

［7］韓 超，方正.外植體和激素對(duì)麗格海棠組培不定芽分化的影響［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28(3):38－41

［8］達(dá)克東，張 松，高東升，等.麗格海棠葉片培養(yǎng)胚狀體發(fā)生和植株再生［J］.園藝學(xué)報(bào)，2001，28(2):180－181

［9］李春秀，石大興，王米力.麗格海棠組織培養(yǎng)外植體再生體系建立關(guān)鍵技術(shù)的研究［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，20(4):330－333

［10］曹福亮，陳 穎，桂仁意，等.麗格海棠組培快繁技術(shù)體系的建立及優(yōu)化［J］.林業(yè)科技開發(fā)，2009，23(5):82－84

［11］文錦芬，鄧明華，施衛(wèi)省，等.麗格海棠離體培養(yǎng)植株再生影響因素的研究［J］.北方園藝，2006(2):110－111

［12］魏翠華，黃 騏，陳 沁.麗格海棠葉片離體培養(yǎng)與工廠化育苗體系的建立［J］.亞熱帶植物科學(xué).2003，32(3):50－52

［13］Manzanera J A，Pardos J A.M icropropagation of juvenile and adult Quercus suber I［J］.PlantCell Tiss Org Cult，1990，21:1 － 8

［14］Purohit S D，Kukda G，Sharma P，et al.In vitro propagation of an adult tree Wrightia lomentosa through enhanced axilliary branching［J］.PlantSci，1994，103:67－ 72

［15］Zimmerman R H，BroomeO C.Phloroglucinol and In vitro rooting of apple cultivar cuttings［J］.J Am SocHortic Sci，1981，106:648 － 652

［16］Haissig B E.Carbohydrate and amino acid concentrations during adventitious root primordium development in Pinus banksiana Lamb.Cuttings［J］.ForestSci，1982，28:813－821