T4噬菌體蛋白的分子改造及其應用前景

逯 凱，顏 晨，任慧英

（青島農業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109）

T4噬菌體是感染細菌的最大的病毒之一，也是目前為止研究得最透徹的噬菌體之一，因易于操作及一些技術上的優(yōu)勢使其成為分子生物學的主要工具。首先，用經典遺傳學方法很容易操作T4噬菌體，如進行位點特異性誘變。同時也很容易增殖。雖然T4噬菌體是最復雜的病毒之一，但是利用X射線技術、冷凍電鏡技術及3D圖像再現(xiàn)技術可以很好地研究和描述它的結構[1－2]。

T4噬菌體可感染大腸埃希菌和與其關系緊密的志賀菌，屬肌尾噬菌體科，是有尾噬菌體，包括扁長的二十面體的頭部、帶有須狀物的頸部、可收縮的尾部和尾絲。在感染過程中，T4用噬菌體復制和表達因子控制細胞的代謝，這些尾絲參與宿主細胞表面的識別并與細菌發(fā)生連接。尾絲末端的基板結合于宿主表面的特異性受體，尾部帶有的酶類降解細菌細胞壁，利于噬菌體核酸的注入。整個尾部就像注射器一樣，通過收縮將核酸注入細菌中。感染的最后過程是裝配和裂解[3]?；蚪MdsDNA緊緊包裹在蛋白質衣殼中。有些病毒的基因組只有5×103bp（如噬菌體 φX174），而 T4基因組龐大[4]，包含1.69×105bp，有289個開放閱讀框，8個tRNA基因和至少2個功能未知的小RNA。超過150個的基因已經被注釋，其中的62種已經被定為最基本的基因。單分子光鑷和熒光的研究表明T4以高達2000bp／s的速度進行DNA的組裝，這是目前報道的DNA組裝中最快的。病毒粒子由約50種蛋白組成，其中頭部蛋白至少有12種。除了核酸之外在病毒粒子中有少量的非蛋白成分，如與DNA有關的多胺類物質（腐胺、亞精胺、尸胺），與尾鞘有關的ATP和Ca2＋及與尾板有關的二氫蝶酰六谷氨酸。人們已經充分了解T4噬菌體的結構，并擁有大量的基因操作技術，可以按照意愿去改變它的性能。因此，T4噬菌體會成為生物技術的試驗品，而且對其的改造可為分子生物學和醫(yī)學生物學開辟新的道路。

1 T4噬菌體頭部的蛋白結構

T4噬菌體頭部的相對摩爾質量為1.94×108g／mol，長115nm，寬85nm，是由160個gp23（主要衣殼蛋白，48.4kg／mol）的六聚體，11個gp24五聚體（五聚頂角蛋白，46kg／mol）和1個gp20（構成在感染過程中DNA組裝完成進入噬菌體的特殊的頂部入口）組成的二十面體。通過原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）可以更形象的觀察T4噬菌體的結構，得到的圖像與電子顯微鏡觀察到的基本一致，而且可以相互補充。通過AFM觀察無水分的含有DNA的頭部大約有75nm長，60nm寬（在液體中觀察時約100nm長，85nm寬）[5]。在頭部前體形成的過程中，蛋白骨架和殼體蛋白要承受gp21（頭部前體蛋白酶，T4PPase）的蛋白水解作用。gp23、gp24、IPⅠ、IPⅡ、IPⅢ及gpalt蛋白的氨基末端被裂解，同時gp22、gp21、gp67和gp68蛋白大部分被消化。gp23六聚體中心之間的距離約為14nm。兩個gp23形成一個約3nm厚的殼體蛋白來保護內部的核酸。頭部的頂角處由gp24構成，gp24形成五聚體和gp23六聚體邊緣相接觸。T4噬菌體衣殼有兩個非必需的外部衣殼蛋白——Hoc和Soc，這兩個蛋白被廣泛應用在二肽展示文庫中并用來展示HIV、腦膜炎雙球菌、炭疽桿菌和FMDV[6]。Soc蛋白在gp23六聚體的表面形成一個幾乎連續(xù)的網眼狀結構。它可以將兩個gp23亞單位結合在一起，但是不能將gp24之間或者gp23和gp24結合在一起。一些研究也顯示Soc與gp23的相互作用比Soc與Soc的相互作用要有利。由gp－Soc形成的骨架環(huán)繞著每個不與gp24相鄰的gp23六聚體。當gp23和gp24相鄰時，Soc分子只占據其中的五個邊，而不包含與gp24相連的一邊。除了那些與gp24相連的gp23分子只與一個Soc分子相連外，大部分都與兩個Soc蛋白相連。Soc分子的位置似乎證實它能夠加強gp23亞單位之間的連接。當gpSoc位于gp23亞單位之間時，將形成三聚體結構，但是當從噬菌體中純化或在體外表達時，gpSoc就以單體形式存在。雖然對Soc蛋白的功能尚未完全了解，普遍認為其在保護噬菌體衣殼對抗熱變性、洗滌劑或者堿性pH方面有重要作用，從而保護噬菌體生命力。

圖1 T4噬菌體頭部的蛋白結構Fig.1 Ther protein structure of bacteriophage T4head

gpHoc（高免疫原性的外部衣殼蛋白，39.1 kg／mol）很可能是T4噬菌體衣殼最具特征的蛋白，它在每個gp23六聚體的中心規(guī)則排列，而且很明顯地從噬菌體的頭部伸出來。突出的部分大約5nm長，相對分子質量約為12kg／mol。Hoc蛋白具有多結構域，由1個約0.19nm高的圓座，一個薄的頸部及一個約2nm寬、2.4nm高的球形頭部組成[7]。gpHoc的功能未知。

2 尾部和尾絲的蛋白結構

在過去的10年里，通過電子顯微照片的三維圖像重建與X射線晶體學技術的應用，對T4噬菌體尾部結構的闡述已經取得了顯著的進步。在20種尾部結構蛋白中，通過X射線晶體學技術確定了其中九種的部分和完整的結構，同時也得到了“伸展的”3D重組結構?！笆湛s的”尾部的3D結構也已明確。如果能夠明確尾部收縮前后的原子分布，我們就能通過基板的亞單位蛋白相對位置的變化了解基板的總體構象變化[8]。尾部和尾絲是T4噬菌體與宿主細胞間相互作用的重要工具，決定了噬菌體感染的特異性。尾部由同軸的兩種蛋白組成。外層圓柱狀的蛋白具有收縮性，內層蛋白為頭部核酸的通道，正是由于像注射器一樣的尾部結構才使得DNA能夠注入到細菌細胞中。內部圓柱體的外徑為9 nm，內徑為4nm，由144個gp19構成。尾部的外層部分叫做尾鞘，由144個gp18構成（和gp19的數(shù)目一致）。尾部的長度很可能由“標尺蛋白”gp29決定。未收縮的尾部長100nm、直徑為21nm，與尾鞘的大小相當，收縮時尾鞘只有36nm長、直徑27 nm。收縮時尾管的長度不變。任何一個圓柱體的末端都是基板和尾絲。基板是一個多聚蛋白，27nm高，最寬的部分有52nm。這些蛋白在2個三聚蛋白（gp9）3和（gp12）3的協(xié)助下環(huán)繞中心部分形成六聚體。gp11，gp10，gp7，gp8，gp6，gp53和gp25的按順序結合構成楔狀物。gp5，gp27，gp29，很可能還有gp26和gp28一起形成基板的中心[9]。gp5擁有一個溶菌酶區(qū)域，這對于噬菌體在感染過程中溶解細菌肽聚糖層是十分必要的。

T4噬菌體最有用的的結構之一就是尾絲：長尾絲（long tail fiber，LTF）和短尾絲（short tail fiber，STF），他們位于尾絲末端，從頸部向外像胡須一樣延伸。LTF主要識別細菌表面的特異性受體，約145nm長，直徑為4nm。每條尾絲由兩部分構成：近側由gp34組成，遠側由gp36和gp37組成。兩部分間由gp35連接，gp35和gp34及gp36相互作用。連接STF和基板的是gp9。尾絲的近側和gp9的聯(lián)系需要gp63的協(xié)助。gp9在感染過程中起著非常重要的作用。在STF和細胞壁上的脂多糖結合之后，gp9就啟動了基板向星狀結構轉變的過程，加之尾絲收縮使得噬菌體的DNA能夠注入到細胞中。gp9與尾絲共同運動，避免對基板的無效觸發(fā)。STF由gp12三聚體構成，由gp11將其連接到基板上。他們有34nm長，棒狀結構，中間部分變窄，而且中間部分的尾絲可以彎曲90°。短尾絲將噬菌體顆粒固定到細菌表面。感染過程中，gp12的C末端緊密結合到脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）的受體的核心區(qū)域。

3 T4噬菌體基因組的突變

T4噬菌體及其他T偶數(shù)噬菌體在早期的誘變研究中都被用作分子模型，由于誘變機制與高等生物相似，其研究結果也被用于更高等生物。在一個復制周期中，T4噬菌體基因組中每個堿基自發(fā)突變（通常是點突變）的概率是1／107，紫外線照射、熱、亞硝酸等物理和化學因素均能夠提高突變頻率。

位點特異性突變可以對特定基因進行突變。用載體系統(tǒng)把在體外引發(fā)的突變導入到噬菌體基因組中，可以研究許多重要基因產物的功能和結構，例如T4噬菌體溶菌酶、DNA聚合酶等。系統(tǒng)性的定點誘變可以發(fā)現(xiàn)氨基酸替換敏感的蛋白質位點，這些敏感的位點包含蛋白質的關鍵氨基酸。有了這個方法，便可以研究單個酶解片段的作用，進一步驗證先前對他們的功能和結構的假設。Karam J D和Konigsberg W H應用位點特異性誘變闡明T4噬菌體DNA聚合酶合成DNA過程中的蛋白質的作用和相互關系，并最終確定了reg蛋白是一種結合到mRNA上、至少調節(jié)12個基因翻譯的阻抑蛋白[10]。位點特異性誘變成為一種研究蛋白質功能和結構的非常有價值的方法。

4 噬菌體展示系統(tǒng)

噬菌體展示系統(tǒng)是用于改造T4噬菌體及其他噬菌體特性的最先進、應用最廣的方法之一。這種技術是將噬菌體編碼基因和非噬菌體蛋白的基因進行融合，并在噬菌體表面進行蛋白表達，融合蛋白作為一種外來蛋白構建進噬菌體粒子中。噬菌體展示中具有里程碑意義的是史密斯的研究工作，他將編碼限制性內切酶EcoRⅠ的基因序列導入F1代噬菌體基因組中，將噬菌體衣殼蛋白pⅢ和細菌限制性內切酶融合在一起。融合蛋白構建進病毒粒子，噬菌體仍保持部分感染性而免疫原性不變。隨后，將克隆區(qū)域轉移到編碼pⅢ蛋白的N端的基因序列中，這樣噬菌體就可以感染本來不能感染的細菌。噬菌體展示技術得到廣泛應用，成為一種收集特定分子的有效工具。在大量單個噬菌體粒子上展示一系列蛋白（如抗體），構建噬菌體文庫，主要用于發(fā)現(xiàn)不同分子的蛋白配體。噬菌體文庫的建立方便了分子篩選，其步驟包括：增殖噬菌體文庫，擴增目的分子；去除未結合的噬菌體粒子；在大腸埃希菌中對目的噬菌體增殖[11]。目前用于構建展示文庫的噬菌體主要有絲狀噬菌體、λ噬菌體、T4噬菌體和T7噬菌體[12]；他們所展示的外源蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性[13]。噬菌體展示技術已經應用于許多方面，如蛋白質和配體之間的相互關系、受體激動劑和頡頏劑的篩選、抗原表位的研究與篩選[13－14]、傳染病的治療及疫苗研究等。噬菌體展示技術能夠展示大量的蛋白質，可以在體內和體外進行篩選，該技術高效、快速、廉價、過程容易控制，也不需要特殊的設備[15]。

T4噬菌體的許多特征利于在病毒衣殼表面進行蛋白分子的展示，尤其在多價疫苗的研制方面。T4噬菌體有兩個非必需蛋白Hoc和Soc，他們對稱地分布在衣殼表面。通過突變修飾或者去除這兩種蛋白并不影響噬菌體的復制、穩(wěn)定或者感染性。這兩種蛋白在病毒表面大量展示，并且在衣殼組裝完成之后、DNA包裝進衣殼之前組裝進頭部。Hoc和Soc的高拷貝數(shù)利于在同一個衣殼上展示多個融合蛋白并控制他們的數(shù)量[16]?？截惖臄?shù)量可以通過改變結合條件來調節(jié)。許多大小、結構、生物學功能不同的蛋白質已經被成功的融合到T4噬菌體的衣殼上。目前的研究熱點集中在展示某些致病菌的抗原，從而開發(fā)高效疫苗。T4噬菌體不僅可用于較大蛋白的展示，而且可同時展示多種蛋白。衣殼缺乏DNA，并且有大量的尾部蛋白，這些特性對開發(fā)噬菌體表面展示蛋白研制疫苗是極其重要的。尾部蛋白與免疫系統(tǒng)相互作用。當展示蛋白誘導的免疫反應受到尾部成分的干擾時，這種作用是理想的；相反，如果尾絲蛋白發(fā)揮很好的免疫輔助作用，就不可行了。王憲文等將豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）衣殼蛋白羧基端基因展示在T4噬菌體表面并成功表達，為檢測 PCV－2陽性血清、測定疫苗免疫效果及PCV－2基因工程疫苗的研究提供了幫助[17]，并同時建立了檢測PCV－2抗體的ELISA方法，與試劑盒檢測的符合率在90%以上，并初步應用于生產實踐中血清樣品的檢測，有望在生產中得以推廣[18]。

5 T4噬菌體衣殼作為治療制劑的平臺

噬菌體作為治療性制劑有幾大優(yōu)勢：噬菌體特異性強，只針對相應的病原菌，而不會破壞正常菌群。噬菌體的作用機制與抗生素完全不同，治療效果不受細菌耐藥性的影響；噬菌體的指數(shù)增殖能力是噬菌體治療的一個顯著優(yōu)勢；噬菌體治療的副作用少，細菌不易對噬菌體產生抗性；不會在體內殘留，噬菌體研發(fā)所需的時間短，成本低，常溫下易保存、運輸[19]。前期的研究表明，不僅能夠在完整的病毒粒子表面展示多肽，還能在空衣殼上進行展示。將腦膜炎奈瑟菌36個氨基酸的PorA肽段克隆進載體，得到了Hoc和Soc的N末端融合肽，并在T4噬菌體衣殼上組裝進了這種穩(wěn)定的多肽。體內試驗證實被展示的PorA具有免疫原性。這些研究表明，以T4噬菌體為基礎的系統(tǒng)不僅能夠調節(jié)被展示多肽的拷貝數(shù)量也能調節(jié)病毒粒子的大小和結構，從而誘導最佳的免疫應答。T4噬菌體的這些特性使其成為開發(fā)新型疫苗的有力工具。

T4噬菌體曾被用于研制疫苗預防超強毒力傳染性法氏囊病病毒（vvIBDV）引起的傳染性法氏囊病，將IBDV中主要免疫原性蛋白VP2融合到T4噬菌體衣殼表面的Soc中，誘導中和抗體產生的抗原表位具有高度的構象獨立性。雖然缺乏有關展示蛋白及病毒粒子結構的信息，但是有理由相信，在T4噬菌體表面展示的VP2能夠維持表位的構象穩(wěn)定，并在雛雞體內誘導高水平的體液免疫。另外，經T4－VP2免疫接種的雛雞能抵抗vvIBDV的攻擊。該項技術切實可行，生產成本低，噬菌體疫苗的保存及運輸又十分方便。另外，這也是首次在噬菌體表面展示441個氨基酸的大蛋白[20]。

將炭疽桿菌保護性抗原PA與T4噬菌體衣殼上的Hoc相融合進行展示，表明被展示的抗原大小沒有重要的限制。后來，應用相同的系統(tǒng)研制了多價炭疽疫苗，將炭疽桿菌毒素蛋白PA、致死因子（lethal factor，LF）及水腫因子（edema factor，EF）單獨或同時融合進Hoc的N端進行噬菌體展示。在不加佐劑的條件下，這些蛋白在小鼠體內誘發(fā)了強烈的免疫應答（與PA單獨展示相比，LF和EF抗原的存在增強了PA特異性免疫應答）。這些研究為多價疫苗的研制提供了可行性，因為病原體通常編碼多種抗原表位，而大多數(shù)疫苗只針對一種抗原。

6 T4噬菌體突變在噬菌體治療中的潛在影響

噬菌體工程的目標之一就是開展噬菌體治療。噬菌體可作為抗生素的替代品用于治療細菌病，將抗生素和噬菌體制劑聯(lián)合使用可能會更好。Szczaurska－Nowak K 等[21]將 B16黑色素瘤接種到小鼠體內，先用常規(guī)抗腫瘤藥如環(huán)磷酰胺（CY）、5－氟尿嘧啶治療（5－FU），然后再使用T4噬菌體制劑，結果顯示T4噬菌體制劑能夠輕微加強環(huán)磷酰胺抑制癌細胞轉移的作用。然而，噬菌體治療受到諸多限制，例如，噬菌體具有高度特異性（甚至在形成活性菌株時產生問題），或由于免疫屏障及患者的免疫應答引起噬菌體從體內消失。對噬菌體衣殼結構進行相對簡單的改造將可以解決這些問題。Merril等得到了來自λ噬菌體的突變株，這些突變株不僅可在小鼠循環(huán)系統(tǒng)中存留很長一段時間，而且比親代毒株具有更好的抗菌效果，他們在λ樣噬菌體的主要衣殼蛋白E上有一個谷氨酸→賴氨酸的點突變，雖然沒有與T4噬菌體相關的相似數(shù)據，這一結果仍為構建能在體內長期存在的T4噬菌體提供新的思路。

有意思的是，已經構建出了T4噬菌體短循環(huán)的突變體。HAP1這個突變體在體外被選作T4噬菌體的亞系，可與哺乳動物細胞系發(fā)生較強作用。奇怪的是，體內試驗顯示，在小鼠器官里這種噬菌體被快速清除。在hoc基因中出現(xiàn)了無義突變，因此導致在噬菌體衣殼上缺少gpHoc，很可能會導致T4噬菌體衣殼上其他有活性的和有免疫原性的成分暴露，并引起機體的強烈的反應[22]。這些研究表明，在噬菌體治療中針對噬菌體的清除而對噬菌體進行的改造，可以有多種方法，根據臨床需要，可以延長或縮短噬菌體在體內的循環(huán)時間。

噬菌體治療的一個問題就是噬菌體對細菌菌株的高度特異性。T4噬菌體的特異性由尾部蛋白gp37的末端來決定，負責與細菌的受體結合。人工誘變能夠改變噬菌體的特異性。T4噬菌體感染大腸埃希菌及親緣關系較近的志賀菌屬。但也有一些突變株能夠吸附假結核耶爾森菌，這種細菌與大腸埃希菌親緣關系較遠。這些突變體中的一種類型在gp37的C末端發(fā)生點突變，出現(xiàn)1個或2個氨基酸的替換。另一種突變類型是在相同區(qū)域中發(fā)生許多基序的不平等交換，這些突變會導致T4噬菌體吸附到假結核耶爾森菌的受體上。通過這種途徑，或許能夠獲得感染新菌株的噬菌體突變株。

T2與T4噬菌體非常接近，具有高度基因同源性和結構相似性。Yoichi M等[23]將T2噬菌體的尾絲蛋白gp37及gp38通過同源重組替換成能特定侵染大腸埃希菌O157：H7的PP01噬菌體的相應蛋白，得到了能感染大腸埃希菌O157：H7的T2ppD1噬菌體。有意思的是，突變的T2噬菌體不再能感染T2噬菌體的天然宿主大腸埃希菌K12。Hashemolhosseini S等[24]研究了T4及其他的T4樣的噬菌體TuIa和TuIb，研究了gp38在決定噬菌體特異性中的作用，確定gp38不是噬菌體衣殼的組成成分，為一種分子伴侶，對gp37形成二聚體是必需的，有助于尾絲形成正確的空間結構從而識別靶多肽。

諸多試驗表明，通過噬菌體展示技術可以顯著改變噬菌體的特異性。Di Giovine M等[25]將腺病毒五鄰體的基因引入M13噬菌體的基因組中，這種蛋白有助于將腺病毒結合并內化進入宿主細胞。眾所周知，噬菌體對真核細胞沒有自然趨向性。M13噬菌體展示了全長的腺病毒五鄰體蛋白，其107個氨基酸的中心區(qū)域可以結合宿主細胞的受體。改造了的M13噬菌體能夠與哺乳動物的細胞發(fā)生相互作用，但是不能在細胞內增殖，也不能引起細胞裂解。

噬菌體治療為應對廣泛耐藥的超級細菌提供了一項新的選擇。這種方法的運用需要首先控制噬菌體活性，并了解其作用機制。噬菌體的特異性方面的研究是一大挑戰(zhàn)，這是噬菌體療法能否成功應用的關鍵。雖然很容易操作T4噬菌體，但對其進行的特異性改造仍處于試驗階段。目前，人們仍然不能隨意改變噬菌體的特異性，但一些研究表明這些改變是可行的。關于T4噬菌體與哺乳類細胞相互作用的研究，提示操縱T4噬菌體基因組或許能導致噬菌體性能方面的重大改變。噬菌體的生活周期及其免疫性能決定了噬菌體治療的應用。相信在未來的研究中，這些性能都會被提高及改善，從而使噬菌體在醫(yī)學和生物學領域具有更廣泛的應用。

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