脂肪干細(xì)胞源性神經(jīng)干細(xì)胞克隆球的電鏡觀察

劉永明 胡曉晴 張 譽 唐穎馨 唐洲平

脂肪組織中存在多能干細(xì)胞，在體外可長期增殖，這類細(xì)胞被稱為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，簡稱脂肪干細(xì)胞（adipose derived stem cells，ADSCs）。ADSCs以其獲取容易、創(chuàng)傷小、具有多分化潛能及避免倫理學(xué)問題等優(yōu)勢逐漸獲得研究者的青睞［1，2］。ADSCs具備向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞分化的潛能［3～6］，最近有報道ADSCs還可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)而向神經(jīng)細(xì)胞分化［7～10］。ADSCs向神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的相關(guān)研究較多，神經(jīng)干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)已有學(xué)者觀察［11］，但對ADSCs誘導(dǎo)分化而來的神經(jīng)干細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察卻不多。本研究旨在采用透射電鏡觀察ADSCs源性神經(jīng)干細(xì)胞克隆球的超微結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 ADSCs體外分離、培養(yǎng)和鑒定［12］

雄性健康SD大鼠，2只／次，體重120～150 g，由同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號為SYXK（鄂）2004－0007；實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。將大鼠麻醉后斷頸處死，置于75%乙醇中浸泡10 min后移入超凈臺。剪開腹股溝處的皮膚，暴露皮下脂肪組織，盡量避開血管，鈍性分離脂肪組織，將所獲得的脂肪組織用眼科剪反復(fù)剪碎，將剪碎后的脂肪組織移入離心管中，加入和剪碎的脂肪組織體積相等的0.1% Ⅰ型膠原酶（Gibco公司），在37℃恒溫?fù)u床振蕩消化40 min，加入等體積基礎(chǔ)培養(yǎng)液［含10%胎牛血清（Hyclone公司）的DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司）］，中和消化液并稀釋細(xì)胞，用吸管反復(fù)吹打混勻，室溫下1100 r／min離心10 min，獲得下層細(xì)胞沉淀物。加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，室溫下1100 r／min離心4 min，去上清，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液后，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，在飽和濕度、5%CO2、37℃標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下培養(yǎng)。以后每3 d全量換液1次，當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底達(dá)到70%～80%時進(jìn)行傳代。

1.2 ADSCs分化成神經(jīng)干細(xì)胞克隆球、鑒定及超微結(jié)構(gòu)觀察

1.2.1 ADSCs向神經(jīng)干細(xì)胞克隆球的誘導(dǎo)培養(yǎng)［8］原代培養(yǎng)的ADSCs細(xì)胞，按5×105／L細(xì)胞濃度接種于25 cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，加入Neurobasal培養(yǎng)基（Gibco公司）、20 ng／ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，b FGF）（sigma公司），20 ng／ml表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（sigma公司）、2%B27添加劑（Gibco公司），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4 d添加上述3種因子，每7 d換液1次。培養(yǎng)5～7 d后可見細(xì)胞在培養(yǎng)液中增殖形成懸浮的神經(jīng)球樣細(xì)胞。當(dāng)形成的神經(jīng)球達(dá)到15～20個時，吸除一半培養(yǎng)基，機械法輕柔吹打神經(jīng)球使之離散，再以Neurobasal培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1∶3傳代。

1.2.2 克隆球鑒定 取誘導(dǎo)培養(yǎng)第10 d的神經(jīng)球，采用免疫熒光法鑒定。將培養(yǎng)著神經(jīng)球的培養(yǎng)液室溫下1500 r／min離心2 min，棄上液，加入2 ml neurobasal培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吹散，滴加到經(jīng)多聚賴氨酸包被的6孔板中，沿側(cè)壁向孔內(nèi)加入1 ml neurobasal培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，讓神經(jīng)球貼壁。去掉6孔板中的培養(yǎng)液，PBS洗5 min×3次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗5 min×3次；0.25%Trixton X－100（Biosharp公司）500 μl破膜20 min，PBS洗5 min×3次；胎牛血清白蛋白（Hyclone公司）封閉非特異性抗原，室溫孵育1 h，PBS洗5 min×3次；吸掉殘液，滴加兔抗大鼠nestin一抗（Sigma公司，1∶150稀釋），4℃孵育過夜，PBS洗5 min×3次；滴加花青素3（Cyanine 3，Cy3）標(biāo)記的羊抗兔二抗（Sigma公司，1∶50稀釋），室溫避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次；50%甘油封片；熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 透射電鏡觀察 將懸浮的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球轉(zhuǎn)入到大試管中，室溫800 r／min離心10 min，將濃縮的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中，室溫1500 r／min離心10 min，去除上清液，沿管壁緩慢加入1%戊二醛固定液（避免將細(xì)胞團打散），透射電子顯微鏡觀察（同濟醫(yī)學(xué)院超微病理研究室）。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下ADSCs及神經(jīng)球形態(tài)

光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察到，培養(yǎng)24 h后大部分ADSCs開始貼壁生長，呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，見圖1A。ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d即見神經(jīng)球樣細(xì)胞出現(xiàn)，并逐漸增多，至10 d左右神經(jīng)球樣細(xì)胞數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定，繼續(xù)培養(yǎng)至14 d左右開始出現(xiàn)變黑的神經(jīng)球樣細(xì)胞團，見圖1B。

圖1 在光學(xué)顯微鏡下ADSCs及ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后形成的神經(jīng)球樣細(xì)胞團的形態(tài) A為培養(yǎng)6 d后的ADSCs（×100倍）；B為ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后出現(xiàn)的神經(jīng)球樣細(xì)胞團（×400倍）

2.2 神經(jīng)球樣細(xì)胞團鑒定

對ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后形成的神經(jīng)球樣細(xì)胞團的免疫熒光鑒定顯示，其Nestin染色陽性，見圖2A－2C。

圖2 熒光顯微鏡下免疫熒光染色顯示神經(jīng)球樣細(xì)胞團Nestin表達(dá)陽性（×400倍）

2.3 電鏡下神經(jīng)球樣細(xì)胞團形態(tài)

透射電鏡下觀察ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后形成的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球，可見細(xì)胞間有增厚的細(xì)胞膜相連（圖3A箭頭所指），或通過一些連接結(jié)構(gòu)相連（圖3B箭頭所指）；單個細(xì)胞的胞體較小，細(xì)胞核較大，胞質(zhì)較少，有多種細(xì)胞器（圖3C）。

3 討 論

ADSCs經(jīng)Zuk等［12］報道后，近年來其研究獲得了迅速的發(fā)展。ADSCs是從脂肪組織中分離出來的、具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。以往研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs與臨床上已廣泛應(yīng)用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無論在形態(tài)、生長特性、分子表型及多向分化能力方面都具有很高的相似性。二者相比，ADSCs來源充足、取材容易、分離培養(yǎng)步驟簡便、體外增殖能力強、沒有倫理學(xué)問題，比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有更多的優(yōu)點。這些特點決定了ADSCs在臨床應(yīng)用中擁有更廣闊的前景。

圖3 透射電鏡下ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后形成的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)（A為標(biāo)尺＝1μm；B和C為標(biāo)尺＝0.5 μm）

ADSCs向神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化是目前相當(dāng)前沿的一個研究領(lǐng)域，是對傳統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞不可再生理論的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，神經(jīng)細(xì)胞不可再生，神經(jīng)損害性疾病基本上無法修復(fù)。但近些年的研究卻顯 示，神 經(jīng) 細(xì) 胞 并 非 不 可 再 生［10］。2000 年Woodbury等報道在含有二甲基亞砜（DMSO）和丁酸酯羥基茴香醚（BHA）或β－巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)液中可將成年大鼠和成人的骨髓基質(zhì)細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞［13］。隨后大量的研究也證實骨髓基質(zhì)細(xì)胞可定向分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［14～20］。因ADSCs和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有高度的相似性，研究者們推測ADSCs也具有分化為神經(jīng)細(xì)胞的可能。Safford等2002年報道在一定的誘導(dǎo)條件下和一定的時間內(nèi)人和大鼠的ADSCs分化的細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測證實分化的細(xì)胞分別表達(dá)巢蛋白（nestin）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）、神經(jīng)元核蛋白（vimentin）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE），提示ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化可以表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的表型［21］。本研究所采用的誘導(dǎo)方法源自Kang等的誘導(dǎo)方法［8］，采用在Neurobasal培養(yǎng)基中加入20 ng／ml b FGF、20 ng／ml EGF、2%B27，經(jīng)過5 d左右的誘導(dǎo)分化即可出現(xiàn)神經(jīng)球樣細(xì)胞團，10 d左右神經(jīng)球細(xì)胞團數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定，經(jīng)免疫熒光染色鑒定顯示Nestin陽性，提示ADSCs經(jīng)過誘導(dǎo)分化后可以表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的表型。

關(guān)于ADSCs向神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化目前已有一些研究報道［22，23］，但對于 ADSCs誘導(dǎo)分化后形成的神經(jīng)球樣細(xì)胞團的超微結(jié)構(gòu)的研究卻很少，本研究即采用透射電鏡，對其超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。本研究結(jié)果顯示，由ADSCs誘導(dǎo)分化而來的神經(jīng)球樣細(xì)胞團的超微結(jié)構(gòu)和原代培養(yǎng)的神經(jīng)球的超微電鏡結(jié)構(gòu)相似［11］，都表現(xiàn)為大部分細(xì)胞的胞體較小，胞核較大，胞質(zhì)少且透明，有微管、微絲、線粒體、高爾基體、糖原等細(xì)胞器；部分神經(jīng)球內(nèi)的細(xì)胞之間可看到多種形態(tài)的連接樣結(jié)構(gòu)。就單一神經(jīng)球而言，未觀察到突觸形成，推測突觸一般只在神經(jīng)組織中存在，而單一的細(xì)胞團之間很難出現(xiàn)典型的突觸結(jié)構(gòu)。另外，神經(jīng)干細(xì)胞本身的突觸結(jié)構(gòu)也不明顯。

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實ADSCs有向神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的可能。此外，本研究創(chuàng)新性地采用透射電鏡，對ADSCs源性的神經(jīng)干細(xì)胞團的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)特征進(jìn)行了觀察，并與原代培養(yǎng)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者具有相當(dāng)程度的相似性。ADSCs研究的迅猛發(fā)展無疑會推動神經(jīng)內(nèi)科疾病治療方法多樣性的發(fā)展，為臨床工作提供更多的幫助。

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