瘤胃中玉米秸稈分解菌的篩選

楊 瓊，孫滿吉，黃麗敏，朱繼紅，張永根

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，大量農(nóng)作物秸稈由于營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低、纖維素含量高，難于被畜禽利用，過多添加反而降低畜禽對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，因此被就地?zé)?，這不僅是一種資源浪費(fèi)，而且對(duì)環(huán)境造成了一定的污染，當(dāng)前如何提高秸稈的利用率成為畜牧業(yè)的熱門話題[1]。目前畜牧業(yè)使用較多的為玉米秸稈，益生菌可在玉米秸稈上進(jìn)行一系列復(fù)雜的生物化學(xué)作用，從而改變秸稈的物理、化學(xué)性質(zhì)?？蓪⒂衩捉斩捴械拇掷w維降解為動(dòng)物容易消化吸收的單糖、雙糖等小分子物質(zhì)，提高飼料的消化吸收率，這是機(jī)械所達(dá)不到的深度生化加工。與此同時(shí)，益生菌在處理玉米秸稈時(shí)還能產(chǎn)生并積累大量營(yíng)養(yǎng)豐富的菌體蛋白及其他有用的代謝產(chǎn)物（維生素、微量元素、有機(jī)酸、醇、醛、酯等），增加了秸稈飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高了秸稈的適口性，有的代謝產(chǎn)物（如促生長(zhǎng)因子）能提高動(dòng)物抗病能力，刺激動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，有的代謝產(chǎn)物（如乙醇、乳酸等）對(duì)飼料還具有防腐作用。利用生物技術(shù)提高其飼用價(jià)值是國(guó)際上研究的熱點(diǎn)，但目前對(duì)秸桿的利用還沒有達(dá)到令人滿意的水平[2-3]。至今，已有很多關(guān)于人工培養(yǎng)純化纖維素降解菌方面的報(bào)道，其中大部分是以純培養(yǎng)方法進(jìn)行分離和篩選[4-6]。本試驗(yàn)通過對(duì)奶牛進(jìn)行玉米秸稈的預(yù)飼，從而提高奶牛瘤胃中玉米秸稈分解菌的數(shù)量，通過剛果紅培養(yǎng)基初篩與中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）降解率復(fù)篩的方法，在瘤胃液中篩選出對(duì)玉米秸稈降解率高的菌株，以期用該菌株作為益生菌添加劑來提高奶牛對(duì)玉米秸稈的利用率。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（100 mL）：CMC-Na 1.0 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，MnSO45×10-5g，蛋白胨1.0 g，酵母膏1.0 g，pH 6.4～6.8。

分離篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g，K2HPO41 g，NaNO33 g，MgSO40.5 g，瓊脂 17 g，蒸餾水1 L，pH 6.4～6.8。

斜面活化保藏培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 L，pH 6.4～6.8。

玉米秸稈培養(yǎng)基：玉米秸稈粉3 g，蒸餾水100 mL（固體培養(yǎng)則不加水），自然pH。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鮮瘤胃液的采集

以玉米秸稈為粗飼料預(yù)飼4頭已裝置永久瘤胃瘺管的奶牛，預(yù)飼期為兩周。晨飼（6:00）后2 h由4頭瘺管牛瘤胃內(nèi)上、下、左、右不同位點(diǎn)采集足量瘤胃液，混合并用兩層紗布過濾，灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)39℃并通有CO2的保溫瓶中，立即蓋嚴(yán)瓶口，迅速返回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 富集培養(yǎng)

取鮮瘤胃液1 mL接種至已滅菌的富集培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)20 h。

1.2.3 菌株的初篩

取富集后的培養(yǎng)液做系列稀釋梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），分別涂布篩選平板，倒置恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，分離出能夠旺盛生長(zhǎng)，并在剛果紅染色、NaCl脫色后可以觀察到菌落周圍有透明水解圈的菌株（用剛果紅0.1%浸染15 min后，再用NaCl 1 mol·L-1水溶液脫色，剛果紅可將未降解的CMC染成紅色，而接種有纖維分解菌的菌落處形成了透明圈）。

1.2.4 菌株的復(fù)篩

挑取透明圈最大的11株菌，先在平板上進(jìn)行連續(xù)劃線純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)使用分離篩選培養(yǎng)基。將純化后的菌株進(jìn)行斜面活化保藏及富集培養(yǎng)20 h并計(jì)數(shù)。取富集培養(yǎng)后的11株菌的菌液10 mL，分別接入玉米秸稈液體培養(yǎng)基中，準(zhǔn)確記錄玉米秸稈粉的重量，每株菌做3個(gè)重復(fù)，厭氧恒溫培養(yǎng)60 h，另做一個(gè)空白對(duì)照組，對(duì)照組不加菌液，而加入等量的無菌水。60 h后將玉米秸稈培養(yǎng)物用定量濾紙過濾，60℃烘干，回潮后稱重，通過測(cè)定處理后玉米秸稈粉的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維，篩選出對(duì)玉米秸稈纖維分解率最大的1株瘤胃菌。

1.2.5 菌株的保藏

將選出的菌株在平板上連續(xù)劃線純化培養(yǎng)40 h，然后接入含斜面活化保藏培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)40 h后放入冰箱中保藏。

1.2.6 菌株表型特征鑒定

用接種環(huán)挑取少許新鮮的菌絲涂布在干凈玻片上的1滴無菌水或是蒸餾水中，風(fēng)干固定，染色。用光學(xué)顯微鏡觀察菌株的形態(tài)特征。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

通過剛果紅篩選培養(yǎng)基從瘤胃液中篩選出11株透明圈大的纖維分解菌。并將11株菌進(jìn)行了純化。復(fù)篩時(shí)以測(cè)定處理后玉米秸稈粉的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維為指標(biāo)，選出對(duì)玉米秸稈纖維分解率最大的1株瘤胃菌該菌的編號(hào)為Q3，該菌株20 h富集培養(yǎng)液的菌數(shù)為2.3×1015個(gè)·mL-1。測(cè)得處理前后的NDF與ADF含量平均值見附表。

附表 Q3菌株處理前后玉米秸稈中NDF、ADF含量%

由附表可以看出，處理后NDF含量從84.72%降低到了77.35%，Q3菌株使玉米秸稈中的NDF含量降低了7.37個(gè)百分點(diǎn)，ADF的含量從51.85%降低到44.78%，降低了7.07個(gè)百分點(diǎn)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，剛果紅培養(yǎng)基上透明圈的大小并不能說明纖維菌對(duì)玉米秸稈的降解率大小，本次篩選出的分解率最大的菌株Q3，其透明圈并不是最大的，這是因?yàn)閯偣t培養(yǎng)基上的透明圈是因?yàn)榫攴纸饬唆燃谆w維素鈉的原因形成的，菌株對(duì)羧甲基纖維素鈉的分解只能說明其內(nèi)切葡聚糖酶活力大小，而菌株分解纖維的能力并不只是由內(nèi)切葡聚糖酶的活力大小決定的，其是由多種酶的特定比例而決定的。

2.2 菌株的表性特征鑒定

本試驗(yàn)所篩出的Q3菌在CMC-Na培養(yǎng)基上的表型特征見圖1，顯微鏡下觀察的Q3菌株特征見圖2。

圖1 CMC-Na培養(yǎng)基上的Q3菌株

圖2 顯微鏡下的Q3菌株

由圖1～2可見，Q3菌株的表型特征為菌落邊緣不規(guī)則、呈輻射狀、為乳白色、顯微鏡下觀察菌體形態(tài)為短桿狀、革蘭氏染色結(jié)果顯示為革蘭氏陽(yáng)性菌。

3 小結(jié)

白腐真菌以其強(qiáng)大的降解能力聞名，經(jīng)白腐真菌發(fā)酵的秸稈，不僅粗纖維含量大幅度下降，而且粗蛋白質(zhì)水平也大幅度提高。侯進(jìn)等在74%的玉米秸稈和1%的石灰中分別添加不同配比的玉米面和麥麩生產(chǎn)的白腐真菌曲種來發(fā)酵奶牛常用粗飼料玉米秸稈，篩選出以玉米秸稈為主料生產(chǎn)白腐真菌菌種的最佳配方，結(jié)果表明，各處理組菌種均能發(fā)酵玉米秸稈，降低粗纖維含量，提高粗蛋白質(zhì)含量；菌種培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量影響極顯著（P＜0.01），對(duì)粗纖維含量影響不顯著（P＞0.05）；74%的玉米秸稈和1%的石灰添加5%的玉米粉、20%的麥麩配合生產(chǎn)的白腐真菌曲種對(duì)玉米秸稈的發(fā)酵效果最好，可降低生產(chǎn)成本，更適宜作為生產(chǎn)白腐真菌菌種的配方[7]。

本試驗(yàn)得到的纖維分解菌對(duì)玉米秸稈有一定的降解作用，該菌株是否適合用作益生菌添加劑還有待進(jìn)一步研究。隨著世界人口的日益增多，“人畜爭(zhēng)糧”的問題日益嚴(yán)重，提高農(nóng)作物副產(chǎn)品——秸稈的利用率迫在眉睫，纖維分解菌的研究已引起了世界學(xué)術(shù)范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注，在飼料行業(yè)中，纖維分解菌目前還存在菌種種類少、研究進(jìn)展緩慢、菌株不穩(wěn)定、市場(chǎng)處于待開發(fā)狀態(tài)、技術(shù)水平較低，存在安全隱患、標(biāo)準(zhǔn)不健全等一系列問題，今后還需進(jìn)行更深入研究和探討，以促進(jìn)反芻動(dòng)物的飼養(yǎng)業(yè)的健康發(fā)展[8]。

[1]宮福臣,楊瓊,李杰.不同秸稈處理技術(shù)及在反芻動(dòng)物中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)飼料,2011（19）:28-30,44.

[2]張子儀.我國(guó)跨世紀(jì)畜牧業(yè)對(duì)飼料資源的需求分析與對(duì)策[J].國(guó)外畜牧科技,1999,26（1）:2-4.

[3]楊游.秸稈資源的開發(fā)現(xiàn)狀與趨勢(shì)[J].畜禽業(yè),2006,196（8）:27-29.

[4]李日強(qiáng),辛小蕓,劉繼青,等.天然秸稈纖維素分解菌的分離選育[J].上海環(huán)境科學(xué),2002（1）:8-11,63.

[5]郝月,楊翔華,張晶,等.秸稈纖維素分解菌的分離篩選[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2005（7）:58-6O.

[6]Percival Zhang Y H,Himmel M E,Mielenz J R.Outlook for cellu?lose improvement:screening and selection strategies[J].Biotech?nology Advances,2006,24（5）:452-481.

[7]侯進(jìn),李婷,李杰.白腐真菌降解玉米秸稈的研究[J].飼料博覽,2010（1）:4-7.

[8]張景玉,黃保華,殷若新.微生態(tài)制劑——益生素的應(yīng)用及發(fā)展前景[J].山東家禽,2001（5）:33-35.