海洋放線菌M1D14代謝產(chǎn)物對幾種重要植物寄生線蟲的抑制作用

田 陽， 李 平， 張 莉， 孫建華＊， 高丙利

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市細胞遺傳與分子調(diào)控重點實驗室，天津 300387；2.浙江東奇生物科技有限公司，湖州 313000）

植物寄生線蟲的分布非常廣泛，其種類已達200多屬5 000多種，每一種植物至少被一種線蟲寄生［1]。植物寄生線蟲對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害嚴重，全世界每年因線蟲危害給糧食和纖維作物造成的損失約為12.7%，對蔬菜、花生、煙草和果樹造成的損失超過20%，直接經(jīng)濟損失達780億美元［2]。根結(jié)線蟲、大豆孢囊線蟲和松材線蟲是農(nóng)林生產(chǎn)中危害十分嚴重的植物寄生線蟲，目前已成為農(nóng)林生產(chǎn)上的重要病原物［3]，其中根結(jié)線蟲感染一般可造成作物產(chǎn)量損失10%～20%，高的達70%以上［4]。近年來，利用生物防治技術(shù)控制線蟲病害成為國際研究的熱點。生防微生物的應(yīng)用是防治植物寄生線蟲病的重要手段，是保護生態(tài)環(huán)境，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有力保證［5－7]。

在線蟲的生物防治中，抗生素的應(yīng)用是較為有效的防治途徑之一。放線菌是抗生素的重要來源之一，其在自然界中廣泛分布于各種不同的自然生態(tài)環(huán)境里，種類繁多、代謝功能各異，是一類有著廣泛實際用途的生物資源［6]。1993年美國Willian Fenical［8]首先提出海洋微生物是一個新的化學(xué)研究資源，將成為新的研究熱點。海洋放線菌產(chǎn)生的抗生素，不僅結(jié)構(gòu)新穎而且活性代謝產(chǎn)物也是最多的，其中90%以上的海洋放線菌活性產(chǎn)物來自于鏈霉菌屬，僅有少量的來自于放線菌的其他菌屬［9]。利用海洋放線菌的代謝產(chǎn)物控制線蟲病害成為防治植物線蟲病的重要發(fā)展方向［10]。目前有很多利用海洋真菌代謝產(chǎn)物殺線的報道，但殺線蟲種類單一［11]。利用海洋放線菌代謝產(chǎn)物防治線蟲的報道不多，本研究是利用海洋放線菌代謝產(chǎn)物對多種植物寄生線蟲進行研究，對于有效利用海洋放線菌具有一定的意義。

海洋放線菌M1D14是課題組篩選出的具有較高殺線蟲活性的生防菌株。本試驗著重對其進行殺線蟲譜研究并初步對其殺線蟲機理進行探索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

海洋放線菌M1D14菌株由浙江東奇生物科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）察 氏 培 養(yǎng) 基 標 準 配 置 為 NaNO32g／L，K2HPO41g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L，KCl 0.5g／L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g／L，瓊脂15g／L，葡萄糖36g／L。

（2）YE培養(yǎng)基標準配置為酵母膏4g／L，麥芽精10g／L，葡萄糖4g／L，瓊脂3g／L。

（3）M8培養(yǎng)基標準配置為可溶性淀粉20g／L，葡萄糖10g／L，酵母膏2g／L，酪蛋白水解物4g／L，牛肉膏2g／L，CaCO33g／L。

1.1.3 供試線蟲

（1）松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus），由天津師范大學(xué)提供。

（2）南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）2齡幼蟲，由浙江東奇生物科技有限公司提供。

（3）大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines）2齡幼蟲，由浙江東奇生物科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 海洋放線菌菌株的獲得及發(fā)酵液制備

（1）海洋放線菌菌株M1D14的純化：將保藏的菌種畫線轉(zhuǎn)接至平板上，28℃，培養(yǎng)5～7d。

（2）海洋放線菌菌株M1D14的種子培養(yǎng)：挑取純化菌株至YE種子培養(yǎng)液中，28℃，200r／min，振蕩培養(yǎng)3d。

（3）海洋放線菌菌株M1D14的發(fā)酵培養(yǎng)：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液按1∶10比例轉(zhuǎn)接至M8培養(yǎng)液中，28℃，200r／min，振蕩培養(yǎng)7d。將發(fā)酵液用甲醇萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，放入－10℃冰箱保存。

1.2.2 南方根結(jié)線蟲卵懸液的制備

采用改良的振蕩法分離法［12－13]。取溫室里接種南方根結(jié)線蟲60d后的番茄的根，將根剪成1～2cm的小段；放于200mL 1%的次氯酸鈉溶液中，在豆?jié){機中攪拌剪切1～4min；將懸浮液快速經(jīng)100目、300目和500目的網(wǎng)篩，上下振蕩網(wǎng)篩，在500目的網(wǎng)篩上即可收集到游離的卵；隨即快速用無菌水沖洗500目篩網(wǎng)上的卵，以除去殘留的次氯酸鈉；再次沖洗振蕩根段以獲取更多的卵，用過篩法收集到離心管中，在底部加入40%蔗糖溶液20mL梯度離心，3 500r／min，5min，吸取界面溶液過500目篩，用水沖洗篩子去除蔗糖，反向?qū)⒙褯_入三角瓶中。加水制成卵懸液，置于4℃冰箱中備用。

1.2.3 供試線蟲的制備

（1）南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲（J2）的制備：將上述南方根結(jié)線蟲卵懸液置于自制孵化器中，加無菌水放置在25～28℃環(huán)境條件下孵化；4d左右會孵出大量的J2，收集到滅菌三角瓶中，置于4℃冰箱中備用。

（2）松材線蟲幼蟲的制備：在無菌操作條件下，將灰葡萄孢（Botrytis cinerea）接種于察氏培養(yǎng)基上，21℃下避光培養(yǎng)7d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，將松材線蟲接種于該菌絲上進行培養(yǎng)繁殖，26℃下避光培養(yǎng)5～7d［14]。通過貝爾曼漏斗法收集松材線蟲［15]，無菌水離心洗滌3次，2 000r／min離心3次，每次3min。用無菌水將離心得到的松材線蟲稀釋為1 000頭／mL的懸液備用。

（3）大豆孢囊線蟲J2的制備：將大豆品種‘黑60’種植在溫室的病原土壤中，孢囊成熟后挖出根系和根系周圍土壤，用過篩法［1]分離孢囊，選取新鮮飽滿成熟的褐色孢囊放在自制孵化池中用0.5%次氯酸鈉溶液消毒3min，再用無菌水沖洗3遍，加入自制孵化池中，在25℃4mmol／L ZnCl2溶液中孵化。4d左右會孵化出大量的J2，收集至滅菌的三角瓶中，置于4℃冰箱備用。

1.2.4 M1D14殺線活性測定

1.2.4.1 不同濃度放線菌M1D14菌株發(fā)酵液對不同線蟲J2的影響

采用梯度稀釋法［16]，在滅菌的96孔細胞培養(yǎng)皿中加入50μL不同濃度的M1D14菌株發(fā)酵液，以無菌水為陰性對照，5μg／mL阿維菌素和苯線磷為陽性對照，分別向處理和對照中加入50μL濃度為1 000條／mL的線蟲，4次重復(fù)，放入25℃培養(yǎng)箱中，24h后記錄線蟲死亡率，計算校正死亡率［17－19]，線蟲死活判斷采用NaOH刺激法［20]。

下同。

1.2.4.2 不同處理放線菌M1D14發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲J2的影響

在滅菌的96孔細胞培養(yǎng)皿中分別加入50μL經(jīng)過高溫高壓滅菌、0.22μm微孔濾膜過濾和未滅菌處理的不同濃度M1D14菌株發(fā)酵液，以無菌水為陰性對照，分別向處理和對照中加入50μL濃度為1 000條／mL南方根結(jié)線蟲J2，4次重復(fù)，放入25℃培養(yǎng)箱中，24h后記錄線蟲死亡率，計算校正死亡率，線蟲死活判斷采用NaOH刺激法。

1.2.4.3 0.22μm微孔濾膜過濾的 M1D14菌株發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲卵孵化的影響

在滅菌的24孔細胞培養(yǎng)皿中加入100μL 0.22μm微孔濾膜過濾的不同處理濃度的 M1D14菌株發(fā)酵液，以無菌水為陰性對照，5μg／mL苯線磷和阿維菌素為陽性對照，分別向處理和對照中加入經(jīng)過10%NaClO消毒的100μL濃度為2 000個／mL南方根結(jié)線蟲卵，4次重復(fù)，放入25℃培養(yǎng)箱中，10d后記錄卵的孵化率［21]。

孵化率＝（線蟲孵化數(shù)／總卵數(shù)）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌M1D14菌株發(fā)酵液對3種線蟲活性的影響

從表1結(jié)果可見，M1D14菌株發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲、松材線蟲和大豆孢囊線蟲幼蟲均有較好的抑制作用，對南方根結(jié)線蟲抑制效果最好、其次是松材線蟲，對大豆孢囊線蟲效果最差。M1D14菌株4倍發(fā)酵液對大豆孢囊線蟲、南方根結(jié)線蟲、松材線蟲的致死率均可達到100%；稀釋16倍后，對南方根結(jié)線蟲、松材線蟲的致死率仍為100%，但對大豆孢囊線蟲致死率顯著下降，僅為19.67%。菌株發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲的抑制作用明顯高于對松材線蟲的抑制作用，在稀釋36倍后，對南方根結(jié)線蟲的致死率在80%以上，但對松材線蟲的致死率低于10%。

表1 不同濃度發(fā)酵液處理24h對3種線蟲幼蟲的毒力1）

2.2 放線菌M1D14菌株不同處理發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲J2的影響

從表2結(jié)果可知，經(jīng)過高溫高壓滅菌和0.22μm微孔濾膜過濾的菌株發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲均有較好的抑制作用，在稀釋16倍時，高溫高壓滅菌和微孔濾膜過濾對菌株的活性沒有顯著影響，但稀釋24倍后，微孔濾膜過濾的發(fā)酵液活性顯著高于高溫高壓滅菌處理的發(fā)酵液活性，顯著低于未經(jīng)滅菌處理的對照組活性。

表2 不同濃度發(fā)酵液處理24h對南方根結(jié)線蟲幼蟲的毒力1）

2.3 0.22μm微孔濾膜過濾的放線菌M1D14菌株發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲卵孵化的影響

從表3結(jié)果可見，M1D14菌株發(fā)酵液不同處理對南方根結(jié)線蟲卵孵化無明顯差異，其作用效果與無菌水相當(dāng)，略低于苯線磷和阿維菌素，沒有表現(xiàn)出對南方根結(jié)線蟲卵孵化的抑制作用。

2.4 M1D14發(fā)酵液與對照藥劑阿維菌素和苯線磷殺線活性比較

由表4結(jié)果可知，M1D14菌株4倍稀釋發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲、松材線蟲和大豆孢囊線蟲的致死率都為100%；5μg／mL阿維菌素對南方根結(jié)線蟲致死率達100%，對松材線蟲致死率為83.36%，對大豆孢囊線蟲致死率為100%；5μg／mL苯線磷對南方根結(jié)線蟲致死率達100%，對松材線蟲致死率為23.6 8%，對大豆孢囊線蟲致死率為1 0 0%。M1D14菌株4倍發(fā)酵液對3種線蟲都有很強的抑制作用，優(yōu)于5μg／mL阿維菌素或苯線磷的抑制作用。

表3 不同濃度菌株發(fā)酵液過濾處理后對南方根結(jié)線蟲卵孵化的影響

表4 M1D14及對照藥劑對3種線蟲J2的毒力1）

3 討論

由于放線菌菌株發(fā)酵液活性成分復(fù)雜，不同成分對不同線蟲的活性位點作用也不盡相同，所以同一菌株的發(fā)酵液對不同種類線蟲的生物活性存在很大的差異。M1D14菌株經(jīng)過高溫高壓滅菌發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲J2活性仍有很大的毒力，說明該菌株發(fā)酵液殺線物質(zhì)耐高溫；經(jīng)過0.22μm微孔濾膜的發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲J2仍有毒力，說明有效成分不是菌體本身，而是其代謝產(chǎn)物。M1D14菌株發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲卵孵化沒有抑制作用，但是對南方根結(jié)線蟲J2具有強毒力，說明M1D14對南方根結(jié)線蟲的作用機理可能是觸殺作用，具體機理尚在進一步的研究中。該菌株不同處理的發(fā)酵液與報道的其他生防菌株相比，使用濃度低，節(jié)約了生產(chǎn)成本，使其具有很好的應(yīng)用前景［4]。

菌株發(fā)酵液對于3種不同線蟲J2的毒力作用與對照藥劑苯線磷或阿維菌素作用相當(dāng)。由于苯線磷為化學(xué)藥物，對環(huán)境有極大的影響，已被列為禁用農(nóng)藥；阿維菌素容易產(chǎn)生耐藥性、對于不同線蟲作用有差異［22－23]。而該菌株發(fā)酵液對3種線蟲J2都有很強的抑制作用，與對照藥劑相比具有對環(huán)境危害小、殺線蟲種類多、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢，開發(fā)前景廣大。

高濃度海洋放線菌M1D14發(fā)酵液對3種重要植物寄生線蟲都有很強的抑制作用，是一株具有廣泛應(yīng)用前景的生物防治菌株。特別是M1D14發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲具有很強的殺線蟲活性，如果應(yīng)用于生產(chǎn)，將對我國北方地區(qū)大棚蔬菜根結(jié)線蟲的防治產(chǎn)生重大影響。對該菌代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的分離純化及安全性評價正在系統(tǒng)深入研究。

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