一種評價甘藍枯萎病菌轉(zhuǎn)化子致病力的方法

李伶俐， 向紅瓊， 李興紅， 嚴 紅， 楊臘英， 燕繼曄

（1.貴州大學農(nóng)學院，貴陽 550025；2.北京市農(nóng)林科學院植物保護與環(huán)境保護研究所，北京 100097；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，儋州 571737）

由甘藍枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans）引起的甘藍枯萎病是一種典型的土傳病害［1]，受害甘藍在苗期即可發(fā)病，最初表現(xiàn)為葉脈變黃，隨著病情的發(fā)展，整葉或全株變黃，進而植株變小而萎蔫，最后枯死，剖開植株的短縮莖可見維管束明顯變褐。該病在大葉芥上的癥狀與甘藍相似，也表現(xiàn)為萎蔫、黃化及枯死［2]。1895年，Smith在美國首次發(fā)現(xiàn)甘藍枯萎病，該病害在美國東北部蔓延，隨后在加拿大、日本等國家也相繼報道［3－6]，近年來，這種病害在我國北京、河北等地發(fā)生并蔓延迅速［7]。生產(chǎn)上除抗病品種選育外，至今沒有其他的有效防治措施。

解析病原真菌的致病機理可以通過特定性狀突變體篩選和鑒定特定性狀基因功能來實現(xiàn)。通過突變體分離致病相關(guān)基因時，如何評價轉(zhuǎn)化子的致病力是最關(guān)鍵的因素。快速、可靠、重復性強、高通量是評價轉(zhuǎn)化子致病力測定的幾個重要指標。國內(nèi)外對甘藍枯萎病菌致病機理的研究還比較匱乏，而建立一種快速評價甘藍枯萎病菌轉(zhuǎn)化子致病力的方法將有助于致病力變異突變體的篩選，為后期克隆控制甘藍枯萎病菌致病力的功能基因、鑒定基因功能、解析甘藍枯萎病菌致病機理提供幫助，也為甘藍枯萎病的防治提供理論支持。本研究在綜合考慮影響篩選致病力變異突變體的基礎(chǔ)上經(jīng)過探索和優(yōu)化，最終建立了一個能夠較好評價甘藍枯萎病菌轉(zhuǎn)化子致病力細微差異的體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

甘 藍 枯 萎 病 菌 （Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans）野生型菌株JZB310079，分離自北京市延慶縣甘藍產(chǎn)區(qū)，保存在北京市農(nóng)林科學院植物保護與環(huán)境保護研究所植物病害綜合防治研究室。

甘藍枯萎病菌轉(zhuǎn)化子共10個，是通過PEG介導將GFP基因轉(zhuǎn)入甘藍枯萎病菌JZB310079的原生質(zhì)體后獲得的隨機轉(zhuǎn)化子（結(jié)果未報道），編號為PDM01～PDM10，均以濾紙片保存于－20℃冰箱。

育苗基質(zhì)（蛭石與土混合），購自北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心。

1.1.2 甘藍品種

‘中甘21’和‘中甘15’，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 甘藍苗種植

將大約5g甘藍種子放入100mL燒杯，加入約70mL 60～65℃的熱水，用玻璃棒不停地攪拌，至水溫降至37℃以下時停止攪拌，繼續(xù)浸泡種子15min，將其均勻地撒在用水浸濕的濾紙上，放入28℃培養(yǎng)箱，過夜萌發(fā)。將育苗基質(zhì)倒入干凈苗盤中，用滅菌牙簽將萌發(fā)出芽的種子播種到育苗盤，輕輕鋪上一層基質(zhì)后澆少量的水，放入溫室培養(yǎng)（25～28℃），每隔24h澆水1次，直至幼苗生長到合適葉齡。

1.2.2 接種體制備

用無菌棉棒將PDA培養(yǎng)基（9cm）上培養(yǎng)3～5d的甘藍枯萎病菌野生型及轉(zhuǎn)化子的菌絲輕輕刮下，用2～3mL無菌水反復沖洗并打斷菌絲，吸取菌絲裝至150mL液體CM培養(yǎng)基的搖瓶中搖培36h（120r／min，28℃），用無菌紗布濾去菌絲，濾液離心（4 000r／min，10min）后，用無菌水將沉淀的孢子稀釋到合適濃度備用。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g／L，葡萄糖20g／L，瓊脂粉1.6%。

液體CM培養(yǎng)基：0.6%酵母提取物，0.3%酶水解干酪素，0.3%酸水解干酪素，1%蔗糖。

1.2.3 接種方法

蘸根法：苗盤中生長到合適苗齡的幼苗放入接種體中浸泡15～20min，植入育苗杯，溫室培養(yǎng)（25～28℃），接種14d后進行病情觀察。

灌根法：稀釋到一定濃度的接種體直接澆灌幼苗的根系部，植入育苗杯中，溫室培養(yǎng)（25～28℃），接種14d后進行病情觀察。

傷根法：用無菌刀片切下幼苗根部約2～5mm的根系部分，稀釋好的接種體浸泡幼苗受傷的根系15min后，植入育苗杯，接種14d后進行病情觀察。

以上3種接種方法都以同樣條件用清水浸泡處理幼苗作為對照，接種14d后進行病情觀察，并且在接種后24h內(nèi)禁止?jié)菜?，此后每?4h澆水1次。

1.2.4 幼苗接種的時期

分別采用苗齡為三葉期和五葉期的甘藍幼苗進行接種，三葉期指第1、2片葉完全展開，第3片葉抽出并剛展開的時期。五葉期指第1～4片葉完全展開，第5片葉抽出并剛展開的時期。

1.2.5 病情指數(shù)

對生長到合適葉齡的甘藍植株接種14d后進行觀察。每個植株按如下標準進行分級：0級，無?。?級，僅子葉變黃，真葉無癥狀；2級，子葉枯死，下部真葉變黃；3級，有1、2片真葉枯死，但心葉無癥狀；4級，整株枯死［8]。病情指數(shù)（DI）計算公式如下：

甘藍品種按以下標準進行抗、感病分類：0＜DI≤10，高抗（HR）；10＜DI≤30，抗?。≧）；30＜DI≤50，中抗（MR）；50＜DI≤70，感?。⊿）；70＜DI，高感（HS）。

1.2.6 甘藍枯萎病菌轉(zhuǎn)化子致病力差異評價

根據(jù)優(yōu)化的最佳方法（合適菌齡、合適苗齡、接種濃度、接種方法等）評價10株甘藍枯萎病菌隨機轉(zhuǎn)化子和甘藍枯萎病野生型菌株的致病力差異，轉(zhuǎn)化子菌株和野生型菌株做一組對照，每個轉(zhuǎn)化子菌株接種5株幼苗，野生型菌株接種10株幼苗，同樣條件下，用清水接種5株幼苗作為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種濃度對甘藍枯萎病發(fā)病的影響

采用蘸根法分別用孢子濃度為1×106個／mL和1×104個／mL的接種體接種三葉期幼苗后，前者的感病數(shù)量要多于后者（見圖1），因此在進行甘藍枯萎病菌轉(zhuǎn)化子致病力評價時采用孢子濃度為1×106個／mL的接種體。

圖1 不同接種濃度對發(fā)病的影響

2.2 不同接種方法對甘藍枯萎病發(fā)病的影響

用蘸根法和傷根法接種，植株感病數(shù)量相當（圖2），發(fā)病率均為90%，而灌根法接種后的感病效果明顯沒有蘸根法和傷根法的效果好，發(fā)病率為67%。這可能是因為蘸根法和傷根法接種體的孢子直接與植株根系接觸，孢子直接侵染接種植株，導致植株感病快。從操作來看，蘸根法更容易操作，故以后的致病力評價試驗優(yōu)先選擇蘸根法。

圖2 不同接種方法對發(fā)病的影響

2.3 不同時期接種對甘藍枯萎病發(fā)病的影響

蘸根法接種三葉期植株后的感病數(shù)量要多于用五葉期植株接種（見圖3）。作者推測可能是因為三葉期的植株較幼嫩，抗病能力不強，容易感病。同時，培養(yǎng)甘藍生長至三葉期時間較短，故在進行轉(zhuǎn)化子致病力評價時采用三葉期的甘藍幼苗。

圖3 不同時期接種對發(fā)病的影響

2.4 轉(zhuǎn)化子致病力的差異分析

甘藍枯萎病菌10個轉(zhuǎn)化子和野生型菌株接種甘藍（品種為‘中甘21’）幼苗后（感病植株見圖4），可以觀察到接種的甘藍幼苗表現(xiàn)不同的發(fā)病程度，見表1。

表1 甘藍接種不同轉(zhuǎn)化子后的病情指數(shù)1）

試驗結(jié)果表明，用蘸根法接種可以比較合理地評價甘藍枯萎病菌轉(zhuǎn)化子的致病力差異，用此方法可以篩選到致病力衰弱或者增強的轉(zhuǎn)化子。

2.5 甘藍品種的抗性

野生型菌株接種三葉期的‘中甘21’，14d后的病情指數(shù)為65（表1），按照前述方法中的甘藍品種抗病性鑒定標準，‘中甘21’對野生型菌株JZB310079而言屬于感病（S）品種。

野生型菌株接種三葉期‘中甘15’，14d后的病情指數(shù)DI為47.5，按照前述方法中的甘藍品種抗病性鑒定標準，‘中甘15’對野生型菌株JZB310079而言屬于中抗（MR）品種。

圖4 轉(zhuǎn)化子和野生型菌株接種結(jié)果的比較

因此，適合甘藍枯萎病菌JZB310079菌株轉(zhuǎn)化子致病力評價的品種為‘中甘21’。

3 結(jié)論與討論

本研究主要從接種方法、不同苗齡、接種體濃度3方面進行探索，研究結(jié)果表明，使用蘸根法或傷根法，接種苗齡為三葉期，接種體孢子濃度為1×106個／mL時，甘藍幼苗的感病數(shù)量較多，與甘藍黑腐病抗性材料篩選［9]的結(jié)果相似。蘸根法或傷根法比灌根法接種幼苗感病數(shù)量更多，可能是由于蘸根法和傷根法中的孢子直接接觸幼苗根部，使其較易發(fā)??；三葉期接種比五葉期接種發(fā)病數(shù)量更多，可能是三葉期植株較幼嫩，抗病性較弱；孢子濃度為1×106個／mL蘸根后的發(fā)病率要高于濃度為1×104個／mL接種的發(fā)病率，可能是接種體的濃度越高植株越易發(fā)病。

試驗過程中應(yīng)注意以下問題：種子浸泡在熱水中時要不停地攪拌種子，以免種子被燙死；把幼苗由苗盤轉(zhuǎn)到育苗杯中時要輕輕拔起，以免幼苗根部被拔斷；接種過程中在做對照時要避免育苗基質(zhì)被雜菌污染，影響試驗結(jié)果。試驗結(jié)果表明：在相同條件下，用野生型菌株和轉(zhuǎn)化子分別接種甘藍幼苗，雖然接種后甘藍幼苗都表現(xiàn)出不同程度的發(fā)病癥狀，但是用轉(zhuǎn)化子的孢子懸浮液接種植株后發(fā)病率要低于用野生型菌株接種的發(fā)病率，有可能是因為所使用的綠色熒光蛋白載體是隨機插入甘藍枯萎病菌的染色體，不排除這個載體剛好插入到致病相關(guān)基因，也不排除在PEG介導的同源重組過程中染色體發(fā)生了缺失、顛換等現(xiàn)象，導致了控制甘藍枯萎病菌致病力的基因發(fā)生突變，表現(xiàn)出菌株致病力下降。但轉(zhuǎn)化子接種甘藍幼苗后植株表現(xiàn)出致病力差異，可以初步表明該接種方法可以用來篩選轉(zhuǎn)化子的致病力變化突變體，該方法為下一步尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化子增強或衰弱突變體的篩選提供了基礎(chǔ)，也為鑒定克隆甘藍枯萎病菌致病力相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。

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