刺五加多糖對斷奶仔豬生長性能和免疫指標(biāo)的影響

韓 杰邊連全劉顯軍張 飛楊侃侃

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866;2.洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)系，洛陽 471022;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)科研種豬場，沈陽 110866)

仔豬的免疫保護主要來自2個方面，一是從母乳中獲得的被動免疫保護，二是自然狀態(tài)下仔豬自身免疫系統(tǒng)發(fā)育形成的主動免疫保護。3～4周齡的仔豬由于自身免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，體液免疫產(chǎn)生的抗體水平和細(xì)胞免疫功能還很低，此時若實施斷奶，仔豬易發(fā)生免疫應(yīng)激，出現(xiàn)生長停滯、飼料效率降低、腹瀉等現(xiàn)象［1－3］。此外，免疫應(yīng)激還是導(dǎo)致“仔豬早期斷奶綜合征”的重要因素之一。因此，采取一定的營養(yǎng)措施增強斷奶仔豬的免疫功能，對緩解斷奶應(yīng)激所致的生長抑制具有重要意義。

刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide，ASPS)是從刺五加根中分離出的水溶性多糖，具有良好的抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、微生態(tài)調(diào)節(jié)、抗感染等功效［4－7］。近年來，ASPS在藥理研究和臨床應(yīng)用上備受關(guān)注，但在畜禽生產(chǎn)中的研究和應(yīng)用卻鮮見報道。本試驗以早期斷奶仔豬為試驗動物，旨在研究ASPS對斷奶仔豬生長及免疫指標(biāo)的影響，并探討其在仔豬飼糧中的最佳添加水平，為ASPS作為免疫調(diào)控劑在仔豬飼糧中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼糧

選取(28±3)日齡、平均體重為(7.13±0.67)kg的“長白×約克夏”二元雜交斷奶仔豬，采用半開放豬舍，地面飼養(yǎng)，自然通風(fēng)，自由采食和飲水，免疫和驅(qū)蟲程序按豬場常規(guī)同步進行?；A(chǔ)飼糧是參照NRC(1998)仔豬營養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼料，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗設(shè)計

將96頭斷奶仔豬隨機分為6組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)4頭豬，試驗期21 d。對照組飼喂不添加抗生素的基礎(chǔ)飼糧，試驗組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加 150、300、500、800 和 1 000 mg/kg ASPS的試驗飼糧。

1.3 試驗材料

ASPS：以刺五加根為原料，采用熱水浸提乙醇分級沉淀工藝提取，苯酚－硫酸法測得多糖純度為 82.5%。

主要儀器：LRHS－150B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(北京萊凱博儀器設(shè)備有限公司)、BioTek-Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)、Uritest－3000型全自動血細(xì)胞分析儀(優(yōu)利特集團有限公司)、過濾除菌裝置和濾膜、96孔聚丙乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(平底)。

主要試劑：稀釋液［0.05 mol/L pH 9.6 碳酸鹽緩沖液、0.01 mol/L pH 7.2 磷酸鹽緩沖液(PBS)］、洗滌液(PBS中加 0.05%吐溫 －20)、封閉液(PBS中加10%胎牛血清)、鄰苯二胺(OPD，美國Sigma公司)、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗豬免疫球蛋白G(HRP－兔抗豬IgG)、臺盼藍(美國Sigma公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、刀豆球蛋白A(ConA，美國Sigma公司)、RPMI-1640完全培養(yǎng)液(美國HyClone公司)、淋巴細(xì)胞分離液。

1.4 試驗過程及樣品制備

試驗于開始和結(jié)束時，清晨稱量空腹仔豬的個體重，記錄始重(initial body weight，IBW)和末重(final body weight，F(xiàn)BW)，計算每頭仔豬的平均日增重(average daily gain，ADG);準(zhǔn)確記錄各重復(fù)中仔豬的投料量和余料量，計算每頭仔豬的平均日采食量(average daily feed intake，ADFI);根據(jù)ADG和ADFI計算料重比(feed/gain，F(xiàn)/G);每日觀察仔豬的腹瀉情況，記錄每天的腹瀉頭次，計算腹瀉率(diarrhea rate，DR)。

試驗第14天，每個重復(fù)隨機取1頭仔豬，肌肉注射1 mg/kg體重雞卵清白蛋白(ovalbumin，OVA，美國Sigma公司，純度＞90%)。試驗第21天，取每個重復(fù)中第14天注射過OVA的仔豬，用真空采血管前腔靜脈采集血液2份，1份用不帶有肝素的普通真空采血管采血5 mL，3 500 r/min離心5 min，分離血清，－20℃冰箱凍存，用于測定血清特異OVA抗體和皮質(zhì)醇水平;1份用肝素抗凝管采血5 mL，于4℃冰箱保存，用于外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(lymphocyte proliferation，LP)的測定。

1.5 檢測指標(biāo)及測定方法

1.5.1 生長性能

1.5.2 腹瀉率

1.5.3 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測定采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量酶反應(yīng)比色法(簡稱MTT法)，在10 mL離心管中加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，然后沿管壁緩慢加入3 mL肝素抗凝血，2 500 r/min離心20 min，取中間白細(xì)胞層約1 mL，加入3～5倍體積的RPMI-1640完全培養(yǎng)液洗滌3次，每次2 000 r/min離心10 min，棄上清。然后將細(xì)胞懸浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，用臺盼藍染色，計數(shù)活細(xì)胞(＞95%)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/mL。

向細(xì)胞懸液中加入ConA(終濃度為5 μg/mL)，另設(shè)一對照組加入等體積的 RPMI-1640完全培養(yǎng)液，然后加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個樣品設(shè) 3 個重復(fù)，置 5%CO2、37℃培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時，于培養(yǎng)板每孔內(nèi)加入10 μL MTT(初始濃度為5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔再加入100 μL 10%十二烷基硫酸鈉(SDS)－0.04 mol/L HCl溶液，30 min后用酶標(biāo)儀于570 nm波長下測定各孔光吸收值(OD值)。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率用刺激指數(shù)(SI)表示，SI=ConA刺激孔OD570nm/對照孔OD570nm。

1.5.4 血清特異性O(shè)VA抗體水平

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定血清特異性O(shè)VA抗體水平。首先用稀釋液與OVA按照50∶1混合制成包被液，加入酶聯(lián)反應(yīng)板各孔，每孔200 μL，37℃包被2 h。棄去孔內(nèi)液體后，用洗滌液注滿各孔，洗滌3次，每次3 min，然后棄去洗滌液;每孔加入100 μL封閉液封閉1 h，洗滌后得包被平板。將100 μL用稀釋液稀釋40倍的待檢血清加入包被板各孔，每個樣本3個重復(fù)，37℃反應(yīng)1 h。再用洗滌液注滿各孔，洗滌3次后，每孔加入100 μL HRP－兔抗豬IgG，37℃反應(yīng)30 min。再用洗滌液注滿各孔，洗滌3次后，每孔加入新配制的底物(40 mg OPD溶于100 mL pH 5的磷酸－檸檬酸緩沖液中，臨用前加入0.15 mL 30%H2O2150 μL，37 ℃反應(yīng) 30 min。最后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4，終止反應(yīng)。最后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值。

1.5.5 血清皮質(zhì)醇水平

采用皮質(zhì)醇ELISA試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)測定血清皮質(zhì)醇水平。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理，然后利用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件中的一般線性模型(GLM)進行方差分析，對不同ASPS梯度的飼糧處理效應(yīng)進行線性和二次曲線回歸分析，采用Duncan氏法進行多重比較檢驗，P＜0.05時確定為差異顯著。并參照文獻［8－9］的分析方法，通過 SPSS 11.5系統(tǒng)的二次曲線回歸分析以及broken-1ine分析，求獲得最大生長速度的添加水平。

2 結(jié)果

2.1 ASPS對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，各組仔豬的IBW差異均不顯著(P＞0.05);500 mg/kg ASPS組和 800 mg/kg ASPS組仔豬的FBW均極顯著高于對照組(P＜0.01)，1 000 mg/kg ASPS 組顯著高于對照組(P＜0.05)。飼糧中添加ASPS對仔豬的ADFI和F/G影響不顯著(P＞0.05)，但能顯著提高仔豬的ADG(P＜0.05)，隨ASPS添加水平增加，F(xiàn)BW 和ADG均呈二次曲線變化(P＜0.01)，F(xiàn)/G呈線性改善(P＜0.05)。通過對 ADG的broken-1ine分析和二次曲線回歸分析可知，獲得最大生長速度的添加水平分別為869和728 mg/kg，可見，在本試驗條件下，ASPS在斷奶仔豬飼糧中的添加量以800 mg/kg為宜。

2.2 ASPS對斷奶仔豬腹瀉率的影響

由表3可知，飼糧中添加ASPS能顯著降低仔豬的腹瀉率(P＜0.05)。與對照組相比，飼糧中添加300(P ＜0.05)、500(P ＜0.01)和 800 mg/kg ASPS(P＜0.01)降低了仔豬的腹瀉率。通過對不同ASPS梯度的飼糧處理效應(yīng)進行線性和二次曲線回歸分析可知，隨ASPS添加水平的增加，腹瀉率呈二次曲線變化(P＜0.01)。

表2 ASPS對斷奶仔豬生長性能的影響Table 2 Effects of ASPS supplementation on growth performance of weaner piglets

表3 ASPS對斷奶仔豬腹瀉率的影響Table 3 Effects of ASPS supplementation on diarrhea ratio of weaner piglets

2.3 ASPS對斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、血清特異性O(shè)VA抗體和皮質(zhì)醇水平的影響

由表4可知，飼糧中添加不同水平ASPS能顯著提高仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(P＜0.05)。與對照組相比，500 mg/kg ASPS組(P＜0.05)、800 mg/kg ASPS 組(P ＜0.01)、1 000 mg/kg ASPS組(P＜0.05)仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著或極顯著升高。隨ASPS添加水平的增加，外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率呈線性變化(P＜0.01)。飼糧中添加不同水平的ASPS對仔豬血清特異性O(shè)VA抗體水平影響均不顯著(P＞0.05)。添加ASPS能顯著降低仔豬血清皮質(zhì)醇水平(P＜0.05)，其中，飼糧中添加500、800和1 000 mg/kg ASPS顯著降低了仔豬血清皮質(zhì)醇水平(P＜0.05)，隨ASPS添加水平的增加，血清皮質(zhì)醇水平呈線性變化(P ＜0.01)。

3 討論

3.1 ASPS對斷奶仔豬生長性能的影響

目前，將ASPS應(yīng)用于斷奶仔豬生產(chǎn)中的研究還未見報道，但有將刺五加水提物應(yīng)用于仔豬生產(chǎn)中的相關(guān)報道。例如，劉合軍等［10］在飼糧中添加0.1%刺五加水提物顯著提高了早期斷奶仔豬的ADFI和ADG，并顯著防治了早期斷奶仔豬腹瀉。燕富永［11］研究表明，0.1%刺五加水提物顯著提高了仔豬ADG，極顯著降低了飼料轉(zhuǎn)化效率(FCR)。本試驗結(jié)果表明，適宜水平的ASPS能顯著提高斷奶仔豬ADG和降低仔豬腹瀉率，這與前述的研究結(jié)果基本一致。但本試驗中ASPS對ADFI及F/G無顯著影響，這與前述在仔豬飼糧中添加刺五加水提物的效果不一致，究其原因，一方面可能因為刺五加水提物與刺五加多糖的成分差異(刺五加水提物是刺五加中多種成分的混合物，除含有ASPS外，還含有刺五加苷、黃酮、微量元素和氨基酸等)所致;另一方面，可能因為ASPS味辛、微苦，而豬的味覺和嗅覺非常靈敏，這可能是導(dǎo)致ASPS對仔豬ADFI無顯著影響的原因。對試驗1～21 d ADG的broken-1ine分析和二次回歸分析，獲得最大生長速度的最佳添加水平分別為869和728 mg/kg，可見，結(jié)合本試驗ASPS的添加水平，APS在斷奶仔豬飼糧中的添加量以800 mg/kg為宜。

表4 ASPS對斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、血清特異性O(shè)VA抗體和皮質(zhì)醇水平的影響Table 4 Effects of ASPS supplementation on peripheral blood lymphocyte proliferation，serum specific ovalbumin antibody and cortisol levels of weaner piglets

3.2 ASPS對斷奶仔豬免疫功能的影響

在ASPS影響細(xì)胞免疫方面，如謝蜀生等［12］研究表明，在小鼠體內(nèi)注射ASPS對小鼠全脾細(xì)胞以及去T細(xì)胞后的脾細(xì)胞都有強的促有絲分裂作用;孟繁磊等［13］研究表明，刺五加葉均一多糖組分對體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有顯著的促進作用。淋巴細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化率)是評價細(xì)胞免疫功能的一個重要指標(biāo)［14］。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，ASPS可以顯著提高斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，這與前述的以往研究結(jié)果一致，提示ASPS有增強機體的細(xì)胞免疫功能的作用，對免疫系統(tǒng)發(fā)育還不完善的早期斷奶仔豬來說，細(xì)胞免疫功能的改善可以在一定程度上增強機體對微生物入侵和疾病的抵抗能力。

在ASPS影響體液免疫研究方面，Han等［15］從刺五加組織培養(yǎng)的果實中分離獲得一種均一化多糖可增加小鼠分泌免疫球蛋白M(IgM)的B細(xì)胞數(shù)量，提示ASPS對小鼠體液免疫功能具有一定影響。本試驗通過給仔豬注射OVA抗體使仔豬致敏以評價體液免疫水平，結(jié)果表明ASPS對仔豬血清特異性O(shè)VA抗體水平影響不顯著，提示ASPS對仔豬體液免疫功能影響不顯著，這與前述的研究結(jié)果不一致，分析這種結(jié)果的差異可能是研究動物小鼠和仔豬的種屬差異所致。

3.3 ASPS對斷奶仔豬斷奶應(yīng)激的影響

皮質(zhì)醇是由下丘腦－垂體－腎上腺軸分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要成分，其水平高低可作為衡量應(yīng)激程度的一個重要指標(biāo)［16］。Founderburke等［17］研究了心理、溫度、營養(yǎng)3種應(yīng)激因素對28日齡斷奶仔豬生理和生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度應(yīng)激組仔豬(環(huán)境溫度從斷奶前29℃降至斷奶后13℃)比自然吮乳組仔豬增重顯著加快，斷奶心理應(yīng)激組和環(huán)境溫度應(yīng)激組血液生長激素和胰島素水平顯著升高，而營養(yǎng)應(yīng)激組仔豬出現(xiàn)失重，血清胰島素水平顯著降低，血清皮質(zhì)醇水平顯著升高。本試驗中ASPS使仔豬血清皮質(zhì)醇水平顯著降低，表明ASPS有緩解應(yīng)激的作用，這也可能是ASPS促進斷奶仔豬生長的原因之一。

4 結(jié)論

①飼糧中添加ASPS可以顯著提高斷奶仔豬的ADG，改善血液免疫指標(biāo)，降低仔豬的應(yīng)激反應(yīng)和腹瀉的發(fā)生。

②在本試驗條件下，ASPS在仔豬飼糧中的添加量以800 mg/kg效果最好。

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