D101大孔吸附樹脂法富集補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂酚的研究*

劉二偉，王家龍，韓立峰

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂（PsoraleacorylifoliaL.）的干燥成熟果實(shí)，性溫，味辛，為常用中藥。已從補(bǔ)骨脂中分離出的化學(xué)成分50余種，包括呋喃香豆素類補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素、單萜酚類補(bǔ)骨脂酚、黃酮類新補(bǔ)骨脂異黃酮、Corylifol A、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚等成分。補(bǔ)骨脂具有植物雌激素樣作用，雌激素的效應(yīng)主要由兩種受體雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ）介導(dǎo)。研究表明激活ERα可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，而ERβ的激活則對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)起抑制作用，因此對(duì)ERβ選擇性激活的藥物被認(rèn)為是長(zhǎng)期使用雌激素的更安全的替代品。本課題組前期研究結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂酚選擇性的激活ERβ，而補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素選擇性的激活ERα。在提取物制備工藝中需要去除補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素而富集補(bǔ)骨脂酚，這對(duì)于補(bǔ)骨脂的安全應(yīng)用具有重要意義[1-6]。

1 儀器和試劑

Waters 2695液相色譜系統(tǒng)；乙腈（色譜醇，TEDIA）；補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚（實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)結(jié)構(gòu)確證，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）。補(bǔ)骨脂藥材（購(gòu)自河北安國(guó)祁新中藥顆粒飲片有限公司，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院郭俊華副研究員鑒定）。D101大孔吸附樹脂（天津市海光化工有限公司，凈品級(jí)）。

2 分析方法

2.1 色譜條件 Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%醋酸水溶液，梯度洗脫，見表1，體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，柱溫 20℃，進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相比例

2.2 線性關(guān)系 精密稱取補(bǔ)骨脂酚5.79 mg、補(bǔ)骨脂素16.35 mg和異補(bǔ)骨脂素10.30 mg，分別置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取各儲(chǔ)備液至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：補(bǔ)骨脂酚Y贊=0.174 5X+2.114 2，決定系數(shù) r2=0.999 4，線性范圍 46.3~231.6 μg；補(bǔ)骨脂素Y贊=7.025 3X+0.540 7，決定系數(shù)r2=0.999 3，線性范圍0.108~4.860 mg；異補(bǔ)骨脂素Y贊=7.428 7X+0.568 1，決定系數(shù) r2=0.999 3，線性范圍0.105~4.730 mg。

3 制備工藝的研究

3.1 補(bǔ)骨脂藥材的提取 取補(bǔ)骨脂藥材1 kg，95%乙醇回流提取2次，每次10 L，2 h，回收乙醇至盡后真空干燥，得補(bǔ)骨脂提取浸膏187.0 g，備用。

3.2 補(bǔ)骨脂提取物的溶解 取步驟3.1所得補(bǔ)骨脂提取物3份，每份4 g。樣品1、樣品2和樣品3分別對(duì)應(yīng)加入1%、2%、3%氫氧化鈉水溶液，觀察溶解情況，結(jié)果見表2。

表2 堿水溶解補(bǔ)骨脂樣品結(jié)果

由表2可見：氫氧化鈉濃度直接影響補(bǔ)骨脂提取物的溶解，盡量少的使用和選擇低濃度氫氧化鈉是優(yōu)選原則，濃度過?。?%）達(dá)不到溶解目的，因此選擇使用2%氫氧化鈉水溶液溶解補(bǔ)骨脂提取物。

3.3 酸沉淀初步富集補(bǔ)骨脂酚 為了初步富集補(bǔ)骨脂酚可以加酸調(diào)節(jié)pH值，補(bǔ)骨脂酚會(huì)不斷析出，同時(shí)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素也會(huì)重新環(huán)合成內(nèi)酯，因此調(diào)節(jié)加酸的量并優(yōu)化加酸的濃度，可以有選擇性的沉淀出補(bǔ)骨脂酚而將大部分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素留在堿水溶液中，同時(shí)去除大部分其他水溶性成分，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分初步富集純化目的。

取步驟3.1所得補(bǔ)骨脂提取物3份，每份4 g。分別加入2%氫氧化鈉水溶液28.0 mL溶解。滴加10%鹽酸沉淀，分別調(diào)節(jié)pH值至10.0、8.0、6.0，靜置過夜，固液分離，溶液依次記錄為母液1、母液2、母液3。沉淀分別用60 mL 95%的乙醇溶解，確定體積，依次標(biāo)記為沉淀1、沉淀2和沉淀3，觀察沉淀狀態(tài)并按2.2色譜條件測(cè)定母液和沉淀中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚的含量，以溶液和沉淀中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚的分配為指標(biāo)優(yōu)化酸沉淀pH值條件，結(jié)果見表3。

表3 補(bǔ)骨脂堿水溶液加酸沉淀結(jié)果mg

加酸的量直接影響補(bǔ)骨脂堿溶液中補(bǔ)骨脂酚的沉淀效果，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，加酸調(diào)節(jié)pH值至10.0時(shí)即有大量沉淀產(chǎn)生，并且母液顏色較深，到8.0時(shí)母液顏色變?yōu)榧t棕色，到6.0時(shí)變?yōu)闇\黃色，沉淀量增加。數(shù)據(jù)顯示，調(diào)節(jié)pH值至10.0時(shí)補(bǔ)骨脂酚已經(jīng)大部分析出，隨著加酸量的增加補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素卻大量增加，因此，選擇補(bǔ)骨脂提取物堿溶液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至10.0的工藝。

3.4 大孔吸附樹脂純化工藝條件的確定

3.4.1 大孔吸附樹脂富集補(bǔ)骨脂酚動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 吸附曲線的繪制有利于確定樹脂對(duì)補(bǔ)骨脂酚吸附能力的大小，稱量提取物28.5 g，按步驟3.3堿水溶解后加鹽酸沉淀，沉淀加入700mL2%氫氧化鈉水溶液溶解，溶液上預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂柱（直徑 2.0 cm，高 45 cm，柱體積（BV）=70 mL），流速3mL/min。每個(gè)柱體積接樣1次，順序接收6份。HPLC測(cè)定溶液中補(bǔ)骨脂酚的含量，以流出液柱體積對(duì)流出液補(bǔ)骨脂酚濃度（mg/mL）作圖，結(jié)果見圖1。

圖1 大孔吸附樹脂富集補(bǔ)骨脂酚的吸附曲線

由圖1可見：補(bǔ)骨脂酚上樣量達(dá)到2倍柱體積時(shí)開始泄露，即達(dá)到飽和，折算為補(bǔ)骨脂95%乙醇提取浸膏，上樣量低于0.08 g/mL樹脂。

3.4.2 大孔吸附樹脂富集補(bǔ)骨脂酚的動(dòng)態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn) 稱取補(bǔ)骨脂95%乙醇提取物3.5g，按步驟3.3堿水溶解后加鹽酸沉淀，靜置過夜后固液分離，沉淀加入2%氫氧化鈉水溶液溶解，上預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂柱（直徑2.0 cm，高45 cm，柱體積BV=70 mL），流速3 mL/min。上柱完畢水沖洗3 BV，30%乙醇沖洗3 BV后用95%乙醇洗脫，每0.5柱體積接樣1次，共接收8份。HPLC法測(cè)定每份樣品中補(bǔ)骨脂酚的濃度，以洗脫體積（0.5 BV）對(duì)補(bǔ)骨脂酚濃度（mg/mL）作圖，結(jié)果見圖2。

由圖2可見：95%乙醇可以作為補(bǔ)骨脂酚的洗脫溶劑，洗脫溶液接收到1 BV時(shí)補(bǔ)骨脂酚開始流出，3 BV時(shí)大部分補(bǔ)骨脂酚已經(jīng)洗脫，因此選擇加入3 BV的95%乙醇洗脫的工藝。

圖2 大孔吸附樹脂富集補(bǔ)骨脂酚的洗脫曲線

4 制備工藝的驗(yàn)證

稱取補(bǔ)骨脂95%乙醇提取物30.0 g，2份，分別按步驟3.3堿水溶解后加鹽酸沉淀，靜置過夜后固液分離，沉淀加入210 mL 2%氫氧化鈉水溶液溶解，溶液上預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂柱（直徑5cm，高50 cm，床體積BV=600 mL），流速10 mL/min。上柱完畢水沖洗3 BV，30%乙醇沖洗3 BV后，用95%乙醇洗脫3 BV，減壓濃縮至干，得12.2 g樣品1、12.9 g樣品2。HPLC測(cè)定兩個(gè)樣品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚的百分含量。結(jié)果見表4。

表4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)樣品中補(bǔ)骨脂酚含量 %

驗(yàn)證結(jié)果顯示本研究確定的工藝可以用于富集補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂酚，所得提取物不含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，平均含量達(dá)45.6%。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)利用補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素堿性條件下開環(huán)成鹽后易溶于水不能被大孔吸附樹脂吸附的性質(zhì)，巧妙的將兩者分開，達(dá)到富集補(bǔ)骨脂酚的目的。實(shí)驗(yàn)證明，本研究確定的工藝可以用于制備不含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，補(bǔ)骨脂酚含量達(dá)到40%以上的補(bǔ)骨脂提取物，為補(bǔ)骨脂的植物雌激素作用的臨床應(yīng)用提供了安全保證。

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