豬背最長肌焦磷酸酶的分離純化與酶學(xué)特性

靳紅果，萬可慧，田銳花，彭增起*，王蓉蓉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095)

豬背最長肌焦磷酸酶的分離純化與酶學(xué)特性

靳紅果，萬可慧，田銳花，彭增起*，王蓉蓉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095)

通過離心、50%～70%飽和硫酸銨沉淀、DEAE-52離子交換柱層析，從豬背最長肌中分離純化出焦磷酸酶(PPase)。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜顯示，PPase分子質(zhì)量約72kD。焦磷酸酶酶學(xué)特性研究表明，最適反應(yīng)溫度和pH值分別為50℃和7.5。Mg2＋是PPase的激活劑，在濃度4.75mmol/L時，酶活力最強。但Na+和K+都能抑制酶的活力，且Na+的抑制效果強于K+。PPase水解焦磷酸鈉(TSPP)的動力學(xué)參數(shù)Vmax為0.086μmol /(L·min))，Km為0.36mmol/L。

焦磷酸酶；純化；酶學(xué)特性；豬肉

焦磷酸鹽常被添加到肉制品如西式火腿、灌腸中用來改善肉的持水性和黏結(jié)性。許多研究指出，焦磷酸鹽可以與肌肉蛋白發(fā)生特異的相互作用[1-2]，有效地解離肌動球蛋白。焦磷酸鈉能提供很高的pH值，所以能賦予肉制品很好的保水性[3]，可以有效改善PSE(pale soft and exudative，PSE)肉加工特性[4]。研究表明，焦磷酸鹽在肉中通過酶解和自身降解兩種途徑水解成正磷酸鹽，目前已證實主要通過酶解的形式進行[5-6]。在不同物種中焦磷酸鹽的水解速率差異很大[7-8]，除了與肌肉內(nèi)環(huán)境因素如pH值、貯藏溫度等有關(guān)外，主要與不同物種中焦磷酸酶(PPsae)的活力有關(guān)[8-10]。自20世紀60年代，Nakamura等[11]對兔肉中焦磷酸酶進行初步研究，發(fā)現(xiàn)有酸性焦磷酸酶和中性焦磷酸酶，后來Morita等[12]對兔肉中的中性焦磷酸酶進行了純化和酶學(xué)特性研究。姚蕊[13]、孫珍珍[14]等分別對雞肉和牛肉中焦磷酸酶進行了研究，但對于豬肉中焦磷酸酶的研究尚未見報道。本實驗以豬背最長肌為材料，通過逐級純化得到焦磷酸酶并對其酶學(xué)特性進行研究。焦磷酸酶的研究對提高焦磷酸鹽在肉中功能效用的發(fā)揮既有理論意義又有實際應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宰后約4h的豬背最長肌，購于南京苜蓿園農(nóng)貿(mào)市場)，4℃條件下迅速預(yù)冷，剔除可見結(jié)締組織和脂肪，待用。

焦磷酸四鈉(TSPP) 美國Sigma公司；寬范圍的蛋白質(zhì)10～250kD Marker、PageRulerTMPlus Prestained Protein Ladder #SM1811 中國Fermentas分公司；DEAE-52美國Whatman公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waring Blender 8010ES高速度組織勻漿機 美國Waring公司；Beckman AvantiJ-E高速離心機 美國Beckman Coulter公司；pH 211 HANNA 臺式酸度計 葡萄牙Hanna公司；AKTA prime蛋白低壓層析系統(tǒng) 瑞典GE Healthcare公司；Mini-Protean 3 cell伯樂電泳儀美國伯樂公司；GelDocTMXR TY4133凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；SpectraMax M2酶標儀 美國分子儀器公司。

1.3 方法

1.3.1PPase的分離純化

1.3.1.1 粗酶液的提取

將冷卻的豬背肌，取100g切成0.5cm3碎丁，加入4倍體積的提取液(25mmol/L Tris-HCl，5mmol/L MgCl2，pH7.0)用Waring Blender勻漿60s(20s轉(zhuǎn)，20s停)。靜置30min(提取更多的水溶性酶)，然后將溶液10000×g離心30min。測定上清和沉淀的焦磷酸酶酶活力，確定焦磷酸酶存在于上清中，棄沉淀取上清。

1.3.1.2 硫酸銨沉淀與透析

將固體硫酸銨研磨之后，在4℃條件下緩慢攪拌加入50%飽和度的硫酸銨，靜置4h，然后4℃條件下10000×g離心30min，棄沉淀取上清并加入固體硫酸銨至70%飽和度，靜置4h，然后4℃、10000×g離心30min，取沉淀用提取液溶解。用移液器將蛋白質(zhì)溶液移入透析袋(截留范圍8000～14400D)，置于提取液中透析，此過程中用磁力攪拌器緩慢攪拌以促進溶液交換。透析24h，更換4次透析緩沖液。

1.3.1.3 離子交換樹脂層析

DEAE-52預(yù)處理材料用25mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2，pH7.0處理浸泡12h后，裝柱(1.6cm×20cm)。利用AKTA prime蛋白低壓層析系統(tǒng)進行分離，用A液(25mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2、1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，pH7.0)平衡DEAE-52離子交換柱，平衡體積60mL，自動上樣2mL，流速0.6min/mL，等待穿刺峰出現(xiàn)后，啟動B液(1mol/L NaCl、25mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2、1mmol/L DTT，pH7.0)，通過自動混合器在0～1mol/L NaCl范圍內(nèi)洗脫，洗脫體積100mL，自動收集器收集各洗脫峰，每管收集5mL。測定不同洗脫峰的酶活力和蛋白含量。

1.3.2PPsae的鑒定

1.3.2.1 非變性凝膠電泳(Native PAGE)

采用Blue Native PAGE，8%分離膠，5%濃縮膠，用考馬斯亮藍R250染色。

1.3.2.2SDS變性凝膠電泳(SDS- PAGE)

采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，10%分離膠，5%濃縮膠，考馬斯亮藍R250染色[15]。

1.3.3 酶活力的測定

焦磷酸酶活力測定參考Yamazaki等[16]的方法。反應(yīng)體系：將50μL焦磷酸酶和50μL底物TSPP置于600μL的離心管，混勻，50℃條件下反應(yīng)15min，用35μL SDSEDTA(13.3%SDS、0.12mol/L EDTA，pH7.0)終止反應(yīng)。之后添加265μL顯色劑(0.5% Fe2SO4、0.5% 鉬酸銨、0.5mol/L H2SO4)，25℃條件下放置15min，然后用酶標儀在640nm波長處測定吸光度。對照組均在添加底物之前加入35μL SDS-EDTA使酶變性。根據(jù)標準曲線計算水解得到的Pi量。以焦磷酸四鈉為底物，以單體磷的釋放量來反映酶活力。酶活力單位(U)的定義為：在反應(yīng)條件下每分鐘轉(zhuǎn)化得到1μmol產(chǎn)物Pi所需的酶量。

1.3.4 溫度對酶活力的影響

將底物與酶反應(yīng)體系分別在pH7.0，不同溫度(25、30、40、45、50、55℃和60℃)下反應(yīng)15min后，測定酶的催化活力。最適溫度下測得的酶活力定義為100%，其余條件下測定的酶活力換算成相對酶活力。繪制酶最適溫度曲線。

1.3.5pH值對酶活力的影響

在pH4～9范圍內(nèi)，選擇0.1mmol/L的緩沖體系：檸檬酸-檸檬酸鈉(pH4、5)，組氨酸-氫氧化鈉(pH6、6.5)，Tris-HCl(pH7、7.5、8、9)。在最適反應(yīng)溫度50℃條件下，測定不同pH值條件下酶的活力。最適pH值測得的酶活力定義為100%，其余條件下測定的酶活力換算成相對酶活力。繪制酶最適pH值曲線。

1.3.6 鹽類對酶活力的影響

在反應(yīng)體系中添加不同濃度的NaCl或者KCl (0、0.1、0.2、0.4、0.6mol/L)，在最適反應(yīng)條件下(pH7.5、50℃)測定酶的活力。以不添加NaCl或者KCl的酶活力為100%，其余條件下測定的酶活力換算成相對酶活力，比較不同鹽離子濃度對酶活力的影響。

1.3.7Mg2+對酶活力的影響

在反應(yīng)體系中添加不同濃度的Mg2+(0.25、1.25、2.5、4.75、9.25、13.75、18.25mmol/L)，在最適反應(yīng)條件下(pH7.5、50℃)測定酶活力，將測定后最大酶活力定義為100%，比較不同Mg2+濃度對酶活力的影響。

1.3.8 底物濃度對酶活力的影響

將50μL含有5mmol/L MgCl2的PPase酶，再加入50μL不同濃度的TSPP，使反應(yīng)體系內(nèi)底物終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1mmol/L，混合后，在最適反應(yīng)條件下(50℃、15min和pH7.5)反應(yīng)后，測定反應(yīng)速度。采用Lineweaver-Burk plot雙倒數(shù)法作圖[17]，求米氏常數(shù)(Km)及最大反應(yīng)速率(Vmax)。

1.3.9 蛋白質(zhì)含量的測定

純化過程中的各過程，除離子交換層析收集管中的蛋白采用考馬斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)量濃度外[18]，其他均采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度[19]。

1.3.10 統(tǒng)計分析

實驗做3次重復(fù)，6個平行。采用軟件Origin 8.0處理分析數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1DEAE-52陰離子交換層析

經(jīng)硫酸銨分級沉淀的酶液，以10mg/mL的蛋白質(zhì)量濃度，通過自動上樣器，進樣2mL，通過PrimeView Chromatography Software自動記錄洗脫條件，如圖1所示。在沒有梯度洗脫的30min內(nèi)出現(xiàn)了穿刺峰，即為一些上樣后沒有與柱子結(jié)合的蛋白。開始洗脫后，在60～100min，120～160min出現(xiàn)了蛋白吸收峰，不同蛋白被分離出來。通過測定酶活力，發(fā)現(xiàn)只有11、12、13管有酶活力，但11、13管酶活力比較微弱，目的蛋白主要存在于12管中。目的蛋白主要為0.35～0.45mol/L NaCl濃度下洗脫出來的成分。通過電泳對12管中目的蛋白做純度鑒定。

圖1 DEAE-52 離子交換圖譜Fig.1 Chromatogram of PPase on DEAE-52 column

2.2PPsae的鑒定

圖2 非變性凝膠電泳Fig.2 Native-PAGE of purified PPase

圖3 SDS變性凝膠電泳Fig.3 SDS-PAGE of purified PPase

實驗分別用變性、非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳對PPase進行鑒定。經(jīng)DEAE-52純化后，非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示的PPase為1條帶(圖1)，變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳也顯示PPase為1條帶(圖2)，分子質(zhì)量約為72kD。結(jié)果表明，經(jīng)過純化后的蛋白質(zhì)中不含雜質(zhì)蛋白，表明實驗已成功的從豬背最長肌中提取了純的PPase。

2.3PPase分離純化效果

表1 豬背最長肌中焦磷酸酶的分離純化結(jié)果Table 1 Purification results of PPase from pork longissimus dorsi muscle

PPase分離純化結(jié)果如表1所示，將PPase純化30.7倍，酶活回收率為8%。

2.4 溫度對PPase活力的影響

圖4 溫度對PPase相對酶活力的影響Fig.4 Effects of temperature on the activity of PPase

由圖4可知，PPase的最適溫度為50℃，在此溫度下，相對酶活力最強，同時，此時的酶促反應(yīng)速率也最大。在25～45℃范圍內(nèi)，隨溫度的上升相對酶活力從41%提高到94%。然而50℃以后溫度繼續(xù)增加，相對酶活力開始快速下降，55℃時相對酶活力下降到66%，當(dāng)溫度達到60℃時，相對酶活力僅8%左右，說明此時大部分酶被破壞，發(fā)生不可逆的熱變性。結(jié)果表明：過高或過低的溫度都會降低酶的催化效率。

2.5 pH值對PPase活力的影響

圖5 pH值對PPase相對酶活力的影響Fig.5 Effects of pH on the activity of PPase

通過測定在不同pH值條件下PPase的相對酶活力，發(fā)現(xiàn)pH值對相對酶活力有較大影響。由圖5可知，酶最適pH值為7.5。當(dāng)pH值在6.5～8.0范圍內(nèi)，PPase的相對酶活力均在60%以上，而當(dāng)pH值小于6.5(偏酸)或大于8.0(偏堿)時，相對酶活力均下降很快。說明PPase適合存在于中性pH值范圍內(nèi)，可以說此酶為中性焦磷酸酶。

2.6 鹽類對PPase活力的影響

圖6 NaCl和KCl對PPase相對酶活力的影響Fig.6 Effects of NaCl and KCl on the activity of PPase

由圖6可知，KCl和NaCl對PPase活力都有抑制作用，只是抑制程度有所差異。當(dāng)KCl和NaCl濃度低于0.2mol/L時，對PPase活力的抑制作用差異不明顯，相對酶活力均保持在80%以上。KCl濃度繼續(xù)增加，相對酶活力下降緩慢，0.6mol/L時相對酶活力為72%，而NaCl濃度繼續(xù)增加，相對酶活力快速下降，0.6mol/L時相對酶活力僅有33%。說明NaCl對PPase活力有強烈的抑制作用。由此推斷這也可能是NaCl能與TSPP起到協(xié)同作用的原因。NaCl抑制了PPase的活力，使得TSPP在肉中的水解速度變慢，延長了發(fā)揮作用的時間，NaCl和TSPP能更好的提取肉中的鹽溶性蛋白。

2.7 Mg2+對PPase活力的影響

圖7 Mg2+濃度對PPase相對酶活力的影響Fig.7 Effects o f Mg2+on the activity of PPase

如圖7所示，不存在或存在低濃度Mg2+時焦磷酸酶的酶活力很低，嘗試在提取過程中不添加Mg2+，在酶活力體系測定中也不添加Mg2+離子的條件下，沒有檢測到PPase的活力。這充分說明Mg2+對于PPase酶的穩(wěn)定和激活作用是必須的。當(dāng)添加0.25～1.25mmol/L Mg2+時，相對酶活力從0.2%上升到24.98%。繼續(xù)增加Mg2+濃度，相對酶活力迅速增加，2.5mmol/L濃度時，相對酶活力是82.6%。當(dāng)Mg2+的濃度達到4.75mmol/L時，PPase相對酶活力達到最大，激活作用明顯。此后Mg2+濃度再增大PPase相對酶活力逐漸平緩下降，隨后在13.75～18.25mmol/L之間形成一個平臺期。由此可見，在該酶起作用時必須有較高濃度的鎂離子存在。

2.8PPase的酶動力學(xué)曲線

圖8 PPase的米氏常數(shù)Fig.8 Kinetic analysis of PPase

添加不同濃度的底物，研究豬背最長肌中焦磷酸酶的動力學(xué)特征，采用雙倒數(shù)作圖法作圖，結(jié)果如圖8所示。在實驗反應(yīng)條件下測定PPase的Vmax為0.086μmol/(L·min)，Km為0.36mmol/L。

3 討 論

對于焦磷酸酶的純化，Nakamura等[11]在兔肉中發(fā)現(xiàn)了兩種焦磷酸酶，一種酸性焦磷酸酶是在18000×g離心的沉淀中得到的，一種中性焦磷酸酶是水溶性的。通過比較，酸性焦磷酸酶的活力遠低于中性焦磷酸酶，所以在肌肉中分解焦磷酸鹽起主要作用的應(yīng)該是中性焦磷酸酶。Matsunaga 等[20-21]在漂洗過程中通過測定魚肉組織中焦磷酸酶的活力也證明了這一點，發(fā)現(xiàn)漂洗次數(shù)越多，肉中焦磷酸酶的活力越低。這主要是因為焦磷酸酶是水溶性的。Gao Ruichang等[23]發(fā)現(xiàn)在魚肉漂洗液中的焦磷酸酶的活力比魚肉中要高，而且在漂洗液中純化得到了焦磷酸酶。本實驗主要從肌漿蛋白中提取得到水溶性的焦磷酸酶。對于不同物種中的焦磷酸酶分子質(zhì)量都不大相同，根據(jù)先前的研究報道，兔骨骼肌中焦磷酸酶的分子質(zhì)量在67kD有兩個亞基在35kD左右。Gao Ruichang等[23]研究發(fā)現(xiàn)鳙魚中焦磷酸酶的分子質(zhì)量為50kD。本實驗只是純化得到了焦磷酸酶，通過SDSPAGE測定該酶的分子質(zhì)量約為72kD。而對于此焦磷酸酶是否有亞基，沒有進一步證實。

溫度是影響酶活力的重要因素。豬肉中焦磷酸酶的最適溫度為50℃。Morita等[22]在測定豬肉乳化腸中添加的焦磷酸鹽水解速率時發(fā)現(xiàn)，將焦磷酸鹽和豬瘦肉、脂肪等原料一起勻漿后的乳化液分別置于15、50、70℃保溫，50℃時，在pH5.6～6.2焦磷酸鹽水解最快。Gao Ruichang等[23]測定鳙魚中的焦磷酸酶的最適溫度也在50℃。在牛肉勻漿物中溫度超過40℃，組織中的酶將失活[24]。而在從牛肉半腱肌純化得到的焦磷酸酶的最適溫度為47℃[14]。說明純化后酶的特性和在勻漿物中非純化酶的特性有所差異。綜上所述，肌肉中焦磷酸酶的最適溫度都在50℃附近，超過此溫度，焦磷酸酶容易熱變性而失活。pH值會影響酶的活力和穩(wěn)定性。Nakamura等[11]和Morita等[12]測定兔肉中性焦磷酸酶的最適pH值均為7.4。本實驗測定的豬背最長肌中最適pH值為7.5，與兔肉中的相差不大。而與牛肉勻漿物中未純化焦磷酸酶的最適pH值在6.7～6.8之間[9]有一定的差異。

有研究表明添加3%的NaCl將會大大減慢PPase在雞肉的水解速率，水解速率只有原來的1/2或者更低[7]。德國學(xué)者同樣發(fā)現(xiàn)NaC1會抑制牛肉勻漿物中未純化焦磷酸酶的活力[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)豬肉中NaCl和KCl的添加可影響PPase的活力。在小于0.2mmol/L NaCl條件下，對酶的抑制作用不明顯，繼續(xù)增加將會強烈抑制酶的活力。KCl對酶活力的抑制作用比NaCl弱，添加0.6mmol/L KCl與添加0.25mmol/L NaCl對酶活力的抑制效應(yīng)相當(dāng)。

對于二價金屬離子對焦磷酸酶的影響，研究者們一直都很關(guān)注。Mg2+是酶中常見的一種激活劑，而且它還影響肉蛋白凝膠的特性。已證實Mg2+是焦磷酸酶的穩(wěn)定劑和激活劑。本實驗中同樣證明了這一點。Mg2+在0～25mmol/L之間時牛肉中焦磷酸酶的活力不斷增加，超過25mmol/L時酶活力保持穩(wěn)定[14]。在咸魚糜中發(fā)現(xiàn)PPase的降解對Mg2+非常依賴，當(dāng)Mg2+濃度3mmol/L時，PPase的水解需要20h，然而在13mmol/L Mg2+條件下，PPase的水解只需要8h[20]。這也從另一方面證明了Mg2+是肌肉中PPase必要的激活劑。本實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬肉中的PPase活力在Mg2+濃度為4.75mmol/L時達到最高，之后非常平緩下降，幾乎形成了一個平臺期，與以上的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

本實驗從豬背最長肌中純化了PPase，純化倍數(shù)為30.7，酶活回收率為8%。PPase最適反應(yīng)溫度為50℃，pH值為7.5。Mg2＋對PPase有激活作用。NaCl和KCl均會抑制PPase的活力。PPase水解的動力學(xué)參數(shù)Vmax為0.086μmol/(L·min)，Km為0.36mmol/L。

[1]YASUI T, FUKAZAWA T, TAKAHASHI K, et al. Phosphate effects on meat, specific interaction of inorganic polyphosphates with myosin B[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1964, 12(5): 399-404.

[2]XIONG Y, LOU X, WANG C, et al. Protein extraction from chicken myofibrils irrigated with various polyphosphate and NaCl solutions[J]. Journal of Food Science, 2000, 65(1): 96-100.

[3]ALVARADO C, SAMS A. Injection marination strategies for remediation of pale, exudative broiler breast meat[J]. Poultry Science, 2003, 82(8): 1332-1336.

[4]ZHENG M, DETIENNE N A, BARNES B W, et al. Tenderness and yields of poultry breast are influenced by phosphate type and concentration of marinade[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81(1): 82-87.

[5]O, NEIL I K, RICHARDS C. Specific detection of polyphos- phates in frozen chicken by combination of enzyme blocking and 31P-FTNMR spectroscopy[J]. Chem Ind, 1978, 2: 65-67.

[6]DOUGLASS M, MCDONALD M, O,NEILL I, et al. Technical note: a study of the hydrolysis of polyphosphate additives in chicken flesh during frozen storage by31P-FTNMR spectroscopy[J]. International Journal of Food Science & Technology, 1979, 14(2): 193-197.

[7]BELTON P S, PACKER K J, SOUTHON T E.31P NMR studies of the hydrolysis of added phosphates in chicken meat[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1987, 40(3): 283-291.

[8]LI R R, KERR W L, TOLEDO R T, et al.31P NMR analysis of chicken breast meat vacuum tumbled with NaCl and various phosphates[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81(6): 576-582. [9]HAMM R, NERAAL R. On the enzymatic breakdown of tripolyphos-phate and diphosphate in minced meat. VI. Influence of pH on th,e tripolyphosphatase and diphosphatase activities in bovine muscle (authors transl)[J]. Zeitschrift f.u.r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung, 1977, 163(3): 213-235.

[10]HAMM R, NERAAL R. On the enzymatic breakdown of tripolyphosphate and diphosphate in comminuted meat. VII. Influence of sodium chloride on the tripolyphosphatase and diphosphatase activity in bovine muscle (author ,s transl)[J]. Zeitschrift f.u.r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung, 1977, 164(1): 34-37.

[11]NAKAMURA S, YAMAGUCHI M, MORITA J, et al. Muscle pyrophosphatases[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1969, 17(3): 633-638.

[12]MORITA J, YASUI T. Purification and some properties of a neutral muscle pyrophosphatase[J]. Journal of Biochemistry, 1978, 83(3): 719-726.

[13]姚蕊, 彭增起, 周光宏, 等. 雞胸大肌中焦磷酸酶的分離純化及特性研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(7): 299-304.

[14]孫珍珍, 彭增起, 靳紅果, 等. 牛肉半腱肌中焦磷酸酶的分離純化及特性研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(5): 160-164.

[15]LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227: 680-685.

[16]YAMAZAKI M, SHEN Q, SWARTZ D. Tripolyphosphate hydrolysis by bovine fast and slow myosin subfragment 1 isoforms[J]. Meat Science, 2010, 85(3): 446-452.

[17]LINEWEAVER H, BURK D. The determination of enzyme dissociation constants[J]. Journal of the American Chemical Society, 1934, 56 (3): 658-666.

[18]STOSCHECK C M. Quantitation of protein[J]. Methods in Enzymology, 1990, 182: 50-68.

[19]GORNALL A G, BARDAWILL C J, DAVID M M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction[J]. J Biol Chem, 1949, 177(2): 751-766.

[20]MATSUNAGA A, OOIZUMI T, YAMAMOTO A, et al. Degradation of polyphosphates during the manufacturing process of surimi-based products: effect of magnesium concentration on enzymatic degradation[J]. Journal of the Food Hygienic Society of Japan, 1997, 38(1): 1-6.

[21]MATSUNAGA A, OOIZUMI T, YAMAMOTO A, et al. Washing effect of minced fish muscle in water on degradation of polyphosphates during manufacturing process of surimi-based products[J]. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries (Japan), 1992, 51(8): 79-83.

[22]MORITA J I, NAGAHASHI T, TANIZAKI A, et al. Measurement of inorganic pyrophosphate in sausage emulsions[J]. Journal of the Faculty of Agriculture, 1983, 61(3): 351-363.

[23]GAO Ruichang, XUE Changhu, YUAN Li, et al. Purification and characterization of pyrophosphatase from bighead carp (Aristichthys nobilis) [J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 41(2): 254-261.

[24]NERAAL R, HAMM R. On the enzymatic breakdown of tripolyphosphate and diphosphate in comminuted meat. XI. Influence of heating and freezing (author, s transl)[J]. Zeitschrift f.u.r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung, 1977, 164(2): 101-104.

Purification and Characterization of Pyrophosphatase from Pork longissimus dorsi Muscle

JIN Hong-guo，WAN Ke-hui，TIAN Rui-hua，PENG Zeng-qi*，WANG Rong-rong
(Key Laboratory of Animal Products Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Pyrophosphatase (PPase) from pork longissimus dorsi muscle was purified by ultracentrifugation, 50%ˉ70% saturated ammonium sulfate fractionation, DEAE-52 anion-exchange chromatography. The purified enzyme with molecular mass of 72 kD ran as a single band on SDS-polyacrylamide gel. The optimum pH and temperature for the isolated PPase was 7.5 and 50 ℃, respectively. Mg2+was necessary for PPase and the activity reached maximum at a concentration of 4.75 mmol/L. Na+and K+inhibited the enzyme activity and the inhibitory effect of Na+was stronger than K+. The kinetic constant Km and Vmax using TSPP as substrate were determined as 0.36 mmol/L and 0.086μmol/(L·min), respectively.

pyrophosphatase；purification；characterization；pork

TS251.1

A

1002-6630(2012)03-0168-06

2011-04-28

靳紅果(1983—)，女，博士研究生，研究方向為肉品加工與質(zhì)量控制。E-mail：jhg83@163.com

*通信作者：彭增起(1956—)，男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：zqpeng@njau.edu.cn