響應(yīng)面法優(yōu)化脂肪酶的固定化條件及其水解橄欖油的特性研究

劉自琴，黃惠華*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

響應(yīng)面法優(yōu)化脂肪酶的固定化條件及其水解橄欖油的特性研究

劉自琴，黃惠華*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

采用Sepharose CL-4B和7種大孔樹脂為載體固定Palatase 20000L脂肪酶，對載體進(jìn)行篩選，以酶活力為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化固定化條件，并考察所制得固定化酶的穩(wěn)定性和水解橄欖油的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：以大孔樹脂HPD-600為載體制得的固定化酶具有較高的活性和良好的穩(wěn)定性。其最優(yōu)的固定化條件為：pH3.9，酶與載體比例為9.1mg/g，吸附時(shí)間1.8h。在最優(yōu)條件下制得固定化酶在最適合條件下測得的酶活力達(dá)到1440U/g，酶活回收率大于50%。固定化酶最適作用溫度為50℃，最適作用pH值為8.0。固定化酶的Km值為0.130g/mL，高于游離酶的Km(0.069g/mL)。固定化酶的熱穩(wěn)定性有一定程度的提高，其重復(fù)操作5次后相對酶活力仍保持在58%以上。

Palatase 20000L脂肪酶；固定化；穩(wěn)定性；響應(yīng)面法

脂肪酶(三?；视王；饷?，EC 3.1.1.3)是使用最廣泛的酶之一。廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)、油脂化學(xué)品、農(nóng)業(yè)化學(xué)、造紙、洗滌和生物表面活性劑的合成及生物柴油生產(chǎn)等工業(yè)[1]。但是脂肪酶的工業(yè)化應(yīng)用主要有兩個(gè)障礙，一是成本高，二是游離脂肪酶的穩(wěn)定性差。為了解決這兩個(gè)障礙，眾多研究者都進(jìn)行了脂肪酶固定化的研究，旨在解決脂肪酶的應(yīng)用難題，使其發(fā)揮更大的工業(yè)用途[2]。固定化酶具有很多游離酶不具備的優(yōu)點(diǎn)，如運(yùn)用固定化酶可以進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)，能更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量；固定化酶一般具有更好的穩(wěn)定性；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；酶的使用效率提高，成本降低等[3]。近年來國內(nèi)外很多專家都對脂肪酶的固定化進(jìn)行了研究，主要集中在載體和固定化方法的選擇方面。相關(guān)研究表明，將脂肪酶固定在瓊脂糖凝膠和大孔樹脂上，可以改善酶的穩(wěn)定性，并且可以重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本[4-8]。

本研究選用Palatase 20000L脂肪酶進(jìn)行固定化，Palatase 20000L具有很強(qiáng)的1,3-專一性，催化活力高，具有廣闊的應(yīng)用前景。以瓊脂糖凝膠Sepharose CL-4B和7種大孔樹脂為載體，采用共價(jià)結(jié)合和物理吸附的方法進(jìn)行固定化，通過評價(jià)各載體固定化的效果選出最優(yōu)的載體，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對該載體固定脂肪酶的固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，并對在最優(yōu)條件下生產(chǎn)的固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酶Palatase 20000L(液體酶，酶活力為520U/mL)丹麥諾維信公司；HPD系列大孔樹脂、D101、AB-8大孔樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；HP20、HP2MGL大孔樹脂 日本三菱公司；Sepharose CL-4B 美國Pharmacia公司；橄欖油 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；磷酸、冰乙酸、乙酸鈉、95%乙醇、聚乙烯醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甘氨酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu Dorporation公司；恒溫水浴振蕩器 常州澳華儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；磁力攪拌器 榮華儀器制造有限公司；PHS-25型pH計(jì) 上海虹益儀器儀表公司。

1.3 大孔樹脂固定脂肪酶

大孔樹脂預(yù)處理：稱取10g樹脂于錐形瓶中，用95%的乙醇浸泡24h，真空抽濾，用1L蒸餾水沖洗。樹脂依次用25mL的5% HCl和5% NaOH溶液浸泡4h后抽濾，用蒸餾水洗至中性。抽濾后置于4℃冰箱中干燥4 h，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

固定化：稱取經(jīng)預(yù)處理的大孔樹脂0.50g于50mL錐形瓶中，加入10mL磷酸緩沖液(pH7.5，0.05mol/L)和600μL脂肪酶(蛋白含量4mg/mL)，置于恒溫水浴振蕩器中吸附5h(37℃，150r/min)。然后真空抽濾，并用100mL緩沖液沖洗載體，抽干后置于4℃冰箱中干燥4h，得到干燥的固定化酶0.25g，并于4℃冰箱中密封保存。

1.4 瓊脂糖凝膠固定脂肪酶

活化：稱取10g凝膠于真空抽濾漏斗中抽干，用100mL 0.5mol/L NaCl溶液沖洗，再用100mL蒸餾水洗，抽干后轉(zhuǎn)移到50mL三角瓶中，然后加入6.5mL 2mol/L NaOH、1.5mL環(huán)氧氯丙烷、15mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56%的1,4-二氧六環(huán)，在40℃恒溫水浴搖床中活化2h。將活化的凝膠真空抽濾后用100mL 0.05mol/L pH7.5的磷酸緩沖液沖洗，抽干后立即偶聯(lián)。

偶聯(lián)：將活化的凝膠0.5g轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入10mL 0.05mol/L pH7.5的磷酸緩沖液和600μL脂肪酶，置于恒溫水浴振蕩器中偶聯(lián)20h。然后真空抽濾，用100mL緩沖液沖洗，抽干后置于4℃冰箱中干燥4h，得到的固定化酶于4℃冰箱中密封保存。

1.5 脂肪酶活力測定

脂肪酶活力測定采用橄欖油乳化法[9]。用超聲的方法制備乳化液，并優(yōu)化乳化液制備的條件(超聲功率、超聲時(shí)間、橄欖油與乳化液的比例)。分別移取4mL磷酸緩沖液(pH7.5，0.05mol/L)和4mL乳化液(橄欖油含量為0.225g/mL)于50mL錐形瓶中，置于37℃恒溫水浴振蕩器中預(yù)熱10min，然后加入游離脂肪酶50μL(固定化酶活力測定時(shí)則加入固定化酶25mg)，180r/min振蕩反應(yīng)20min，加入15mL 95%乙醇停止反應(yīng)。用0.05mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定反應(yīng)產(chǎn)生的脂肪酸，酚酞為指示劑。酶活力單位定義為：在上述條件下，每分鐘生成1μmol脂肪酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，用U表示。

1.6 載體的固定化率和酶活力回收率測定

固定化時(shí)溶液中的蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定。

式中：m1為固定前溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/μg；m2為固定后溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/μg。

1.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對固定化酶活力影響較大的3個(gè)因素，以固定化酶活力為指標(biāo)，在30℃條件下固定化，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，采用Design-Expert 7對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素表Table 1 Factors and levels in response surface design因素 水平－1 0 1 A pH 3 4 5 B時(shí)間/h 1 2 3 C酶與載體比例/(mg/g) 6 8 10

1.8 Palatase 20000L固定化酶的水解性質(zhì)研究

1.8.1 固定化酶和游離酶的最適作用溫度測定

在pH7.5條件下，分別在溫度為25、30、37、45、50、55、60℃測定Palatase 20000L游離酶和固定化酶的水解活力。

1.8.2 固定化酶和游離酶的最適作用pH值測定

在一定溫度條件下(游離酶45℃，固定化酶50℃)，分別在pH值為4、5、6、7、7.5、8、9、10測定Palatase 20000L游離酶和固定化酶的水解活力。

1.8.3 固定化酶和游離酶的Km值測定

采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法進(jìn)行固定化酶和游離酶的Km值測定。固定酶的濃度，在不同底物質(zhì)量濃度(0.0675～0.1575g/mL)條件下測定酶反應(yīng)的初速率，以初速率的倒數(shù)對底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)作圖，得一直線。由式(3)即可算出Km值。

式中：V為反應(yīng)初速率/(μmol/(mL·min))；[S]為底物質(zhì)量濃度/(g/mL)。

1.9 Palatase 20000L固定化酶的穩(wěn)定性研究

1.9.1 固定化酶和游離酶的pH值穩(wěn)定性測定

將Palatase 20000L游離酶和固定化酶分別在pH值為4、5、6、7、8、9、10的緩沖液中處理2h，然后測定處理后的酶活力，定義未經(jīng)處理的酶活力為100%。

1.9.2 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性研究

將Palatase 20000L游離酶和固定化酶分別在50、60、70、80、90℃處理2h，然后測定酶活力，定義未經(jīng)處理的酶活力為100%。

1.9.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性研究

將4mL磷酸緩沖液(pH8.0，0.05mol/L)和4mL橄欖油乳化液(橄欖油含量為0.225g/mL)置于50mL錐形瓶中，于50℃恒溫水浴振蕩器中預(yù)熱10min，然后加入25mg固定化的Palatase 20000L，精確反應(yīng)20min后，用移液槍移取4mL反應(yīng)液與7.5mL 95%乙醇混合后用0.05mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定反應(yīng)產(chǎn)生的脂肪酸，酚酞為指示劑，然后計(jì)算出固定化酶的酶活力。將余下的反應(yīng)液與固定化酶采用過濾的方式分離出固定化酶，然后按上述方法測定第2次使用時(shí)固定化酶的活力。按此方法測定5次，得出固定化酶在重復(fù)使用5次時(shí)每批次的酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化載體及固定化方法的選擇

分別選用了7種大孔樹脂和Sepharose CL-4B作為載體對脂肪酶進(jìn)行固定。由表2可知，HPD-600可以較好的固定脂肪酶，并得到較高的酶活力。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用HPD-600作為載體，進(jìn)行固定化條件的優(yōu)化與固定化酶的特性研究。

表2 不同載體對脂肪酶固定化效果的比較Table 2 Comparison of the effectiveness of different carriers in lipase immolbilization載體 固定化率/% 酶活力/(U/g) 酶活回收率/%HP20 79 172 14 HP2MGL 37 20 1.6 AB-8 91 232 19 D101 79 140 11 HPD-100 86 280 22 HPD-400 78 212 17 HPD-600 87 320 26 Sepharose CL-4B 20 25 4

2.2 HPD-600固定Palatase 20000L的條件優(yōu)化

2.2.1 吸附溫度對酶固定化效果的影響

將0.50g載體、600μL酶和10mL緩沖液(pH7.5)混合后分別在25、30、37、45、55℃條件下固定5h，測定各溫度條件下脂肪酶的固定化率和相對酶活力。結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在吸附溫度低于37℃時(shí)，隨著溫度的升高，固定化率增大，固定在載體上的酶的相對酶活力增加，高于37℃后固定化率趨于穩(wěn)定。在30℃時(shí)相對酶活力達(dá)到最大值，再升高溫度則會導(dǎo)致相對酶活力急劇下降。這是因?yàn)檩^高溫度下蛋白分子運(yùn)動(dòng)加劇，減小了酶的擴(kuò)散限制作用，使酶分子能更快擴(kuò)散進(jìn)入載體的孔道內(nèi)并與載體發(fā)生相互作用，加快固定化[10]。但高溫會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶因熱變性而失活。

2.2.2 pH值對酶固定化效果的影響

將0.50g載體，600μL酶分別和pH值為2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10的10mL緩沖液混合后在30℃條件下固定5h，并測定各pH值條件下的固定化率和相對酶活力，結(jié)果見圖2。在pH值為2～6時(shí)，固定化率沒有明顯變化，pH值再增大會導(dǎo)致固定化率的降低，而相對酶活力在pH值為4時(shí)達(dá)到最大值。緩沖液的pH值會影響酶分子周圍的離子微環(huán)境，從而影響固定化酶的活力，在特定的pH值條件下，酶分子的活性基團(tuán)能處于最佳的離子狀態(tài)，從而使酶顯示出較高的相對酶活力[6]。

2.2.3 吸附時(shí)間對酶固定化效果的影響

將0.50g載體、600μL酶和10mL緩沖液(pH4)混合后在30℃條件下分別固定1、2、3、4、5、7h，測定不同吸附時(shí)間條件下的固定化率和相對酶活力，結(jié)果見圖3。隨著吸附時(shí)間的延長，載體的固定化率在增大，在2h后基本達(dá)到平衡，吸附剛開始時(shí)，載體上的吸附位點(diǎn)很多，傳質(zhì)的驅(qū)動(dòng)力大，吸附迅速[11]。吸附時(shí)間超過2h后，相對酶活力開始下降，因?yàn)槊阜肿釉谳d體上開始積聚，影響了酶分子的擴(kuò)散，降低了暴露的活性位點(diǎn)數(shù)量[10]，且在長時(shí)間的振搖過程中部分酶會失活，因此選擇2h為最佳吸附時(shí)間。

2.2.4 游離酶與載體比例對酶固定化效果的影響

研究酶添加量(用蛋白含量計(jì)算，酶液的蛋白含量為4mg/mL)與載體的比例為4、6、8、10、12、16、20、24mg/g時(shí)的固定化率和相對酶活力。pH4.0，30℃條件下固定2h，結(jié)果見圖4。隨著酶添加量的增多，相對酶活力增大，但是固定化率和酶活回收率都在下降。當(dāng)酶添加量較小時(shí)，載體吸附的酶量少，酶可以更加分散，增大它與底物接觸的比表面積，活性部位更加暴露，提高反應(yīng)效率，但當(dāng)酶添加量大時(shí)，載體上吸附的酶增多，空間位阻增大，影響酶活性中心和底物的接觸，從而降低了反應(yīng)效率，導(dǎo)致相對酶活力和酶活回收率下降[12]，因此本研究選擇酶與載體比例為8mg/g作為最優(yōu)的酶添加量。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化固定化條件

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface design and results試驗(yàn)號 A B C 酶活力/(U/g)1－1 －1 0 837 2 1－1 0 755 3－1 1 0 743 4 1 1 0 708 5－1 0 －1 696 6 1 0－1 625 7－1 0 1 872 8 1 0 1 837－1 －1 779 10 0 1 －1 813 11 0 －1 1 970 12 0 1 1 926 13 0 0 0 1017 14 0 0 0 1076 15 0 0 0 1002 16 0 0 0 1019 17 0 0 0 1029 9 0

采用Design-Expert 7對表3的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析得到回歸方程和響應(yīng)面圖。由圖5～7可以看出各因素對響應(yīng)值的影響變化趨勢，且回歸模型存在最大值，說明各個(gè)因素都有一個(gè)最適合的值。

酶活力回歸模型P＜0.0001(Prob＞F)，說明模型十分顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，說明模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。一次項(xiàng)C以及二次項(xiàng)B2的P值小于0.0001，十分顯著，一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、C2高度顯著。在原有的擬合方程基礎(chǔ)上，對擬合方程進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化，去掉不顯著的交互相AB和AC，失擬值由1.28變?yōu)?.99，因此去掉交互相AB和AC可以使方程獲得更好的擬合效果。優(yōu)化后的回歸方程為：酶活力/(U/g)=1028.67－27.94A＋18.81B＋86.49C＋19.76BC－191.12A2－76.80B2－79.99C2。

決定系數(shù)R2為97.63%，校正決定系數(shù)為0.9527，說明該模型能解釋95.27%響應(yīng)值變化，僅有4.73%的變異不能用此模型解釋，說明回歸方程的擬合程度很好，能夠真實(shí)地反映數(shù)據(jù)結(jié)果[13-15]。

2.3.2 最優(yōu)值的確定

利用回歸方程確定最佳固定化條件，最佳條件為：固定化時(shí)間1.81h、pH3.93、酶與載體比例為9.13mg/g。采用上述優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行酶的固定化，考慮到實(shí)際操作的便利，將工藝參數(shù)改為：固定化時(shí)間1.8h、pH3.90、酶與載體比為9.1mg/g。在此酶解條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，平均酶活力為1032U/g，與預(yù)測值1056U/g相比，其相對誤差為2.3%，這說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃侠怼?/p>

2.4 Palatase 20000L固定化酶的水解性質(zhì)研究

2.4.1 水解溫度對固定化酶和游離酶的水解活力影響如圖8所示，固定化酶和游離酶分別在50℃和45℃時(shí)達(dá)到最大水解活力，酶經(jīng)固定后，熱穩(wěn)定性有所提高，所以最適作用溫度也隨之提高。

2.4.2 pH值對固定化酶和游離酶的水解活力影響

如圖9所示，固定化酶和游離酶的最適作用pH值均為8.0。Palatase 20000L脂肪酶在固定化后的最適作用pH值并沒有改變。

2.4.3 固定化酶和游離酶的Km值比較

由圖10可知，固定化酶和游離酶的Km分別為0.130g/mL和0.069g/mL。固定化酶的Km值比游離酶的Km值大，這是因?yàn)槊腹潭ㄔ谳d體上后，使底物與酶活性部位的接觸比面積減小，降低了其與底物的親和力，反應(yīng)速率也相應(yīng)降低[12]。

2.5 Palatase 20000L固定化酶的穩(wěn)定性研究

表4 固定化酶和游離酶的pH值穩(wěn)定性Table 4 pH stability of free and immobilized lipases酶種類 相對酶活力/%未處理 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10固定化酶 100 99 91 93 83 80 58 46游離酶 100 98 93 90 84 79 57 36

由表4可知，Palatase 20000L脂肪酶固定化后的pH值穩(wěn)定性并沒有明顯提高，游離酶和固定化酶在pH4～6內(nèi)都有很高的穩(wěn)定性，處理2h后相對酶活力變化很小。隨著pH值的增大，游離酶和固定化脂肪酶的穩(wěn)定性也開始下降。pH7～8處理2h相對酶活力保持在80%左右，pH9處理2h后能保持60%左右的相對酶活力，而在pH10中處理2h能保持35%以上相對酶活力。

表5 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性Table 5 Thermal stability of free and immobilized lipases酶種類 相對酶活力/%未處理 50℃ 60℃ 70℃ 80℃ 90℃固定化酶 100 96 80 58 40 18游離酶 100 75 72 50 35 2

由表5可知，固定化酶的熱穩(wěn)定性較游離酶相比有提高，在不同溫度條件下處理后的相對酶活力都較游離酶高。酶經(jīng)過固定化后通常會降低其在不利環(huán)境中構(gòu)像變化的自由度，因此在熱穩(wěn)定性方面會較游離酶有一定的提高[16]。

酶的固定化可以提高酶的重復(fù)利用率，降低生產(chǎn)成本，因此，固定化酶的重復(fù)利用性能(操作穩(wěn)定性)是反映固定化效果的重要指標(biāo)。研究了HPD-600固定化Palatase 20000L所得固定化酶水解橄欖油乳化液時(shí)，循環(huán)5次的操作穩(wěn)定性。由圖11可知，該酶在循環(huán)使用5次后仍能保持58%以上的相對酶活力，具有良好的操作穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

HPD-600大孔樹脂具有好的固定化脂肪酶的能力，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到其固定Palatase 20000L脂肪酶的最優(yōu)條件為：固定化溫度30℃、固定化pH3.9、酶與載體比例為9.1mg/g、吸附時(shí)間1.8h。在最優(yōu)條件下制得固定化酶在最適合條件下測得的酶活力為1440U/g，酶活力回收率大于50%。固定化酶和游離酶的最適作用溫度分別為50℃和45℃，最適作用pH值均為8.0。固定化酶的Km值為0.130g/mL，高于游離酶的Km值(0.069g/mL)。固定化酶的熱穩(wěn)定性有一定程度提高，其重復(fù)操作5次后相對酶活力仍保持在58%以上。

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Optimization of Immobilization of Lipase Using Response Surface Methodology and Its Performances in Olive Oil Hydrolysis

LIU Zi-qin，HUANG Hui-hua*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Different carriers such as Sepharose CL-4B and seven kinds of macroporous resins were used to immobilize lipase Palatase 20000L. The lipase showed higher activity and better stablity when immpbilized on macroporous resin type HPD-600 compared with other carriers. Ressponse surface methodolgy was employed to optimize key conditions for the immobilization of lipase Palatase 20000L on macroporous resin type HPD-600 to achieve maximum immobilized lipase activity. The optimal immobilization conditions were found as follows: pH 3.9, enzyme-to-carrier ratio 9.1 mg/g, and adsorption time 1.8 h. Under these conditions, the immobilized lipase achieved its maximum activity, 1440 U/g and a rantivity ecovery above 50%. The optimal reacton temperature of the immobilized lipase was 50 ℃, the optimal reaction pH 8.0, and theKm value 0.130 g/mL, which was higher than that (0.069 g/mL) of the free form. Moreover, the immobilized lipase showed higher thermal stability and maitained over 58% of its original activity after the fifth repeated use.

lipase Palatase 20000L；immobilization；stability；response surface methodology

Q814.2

A

1002-6630(2012)03-0184-06

2011-02-27

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2010AA101505)

劉自琴(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：ziqinliu@126.com

*通信作者：黃惠華(1959—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)及農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：fehhuang@scut.edu.cn