荔枝皮原花青素與VC、VE的協(xié)同抗氧化研究

周瑋婧，隋 勇，孫智達,*，謝筆鈞

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.武漢市食品藥品檢驗所，湖北 武漢 430012)

荔枝皮原花青素與VC、VE的協(xié)同抗氧化研究

周瑋婧1,2，隋 勇1，孫智達1,*，謝筆鈞1

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.武漢市食品藥品檢驗所，湖北 武漢 430012)

選取荔枝皮原花青素(LPPC)，采用DPPH自由基清除實驗與等輻射分析法(Isobologram)相結(jié)合，探討荔枝皮原花青素、VC、VE單獨和復(fù)配后的抗氧化作用，結(jié)果顯示：荔枝皮原花青素、VC和VE的IC50值分別為9.98、9.21、27.96mg/L，表明荔枝皮原花青素對DPPH自由基有明顯的清除作用。Isobologram分析圖中荔枝皮原花青素與VC、VE復(fù)配后的效應(yīng)點都在相加線及95%可信限的下方，理論IC50add值與實驗IC50mix值有顯著性差異，并且相互作用指數(shù)都小于1，證實荔枝皮原花青素與VC，荔枝皮原花青素與VE之間存在協(xié)同抗氧化效應(yīng)。

荔枝皮原花青素；抗氧化；Isobologram分析；協(xié)同作用

荔枝為無患子科植物荔枝(Litchi chinensisSoon.)的果實，荔枝皮主要含花色素類、原花色素類、揮發(fā)性成分、脂肪族化合物及多種營養(yǎng)成分，主要藥效有降糖、降血脂作用，很有開發(fā)價值[1]。復(fù)合抗氧化劑相比于單一抗氧化劑抗氧化活性高、成本低，以及可避免抗氧化劑的過多使用可能帶來的安全問題，有很好的應(yīng)用前景[2]。等輻射分析法(Isobologram)多用于藥物相互作用的研究，基于兩種能產(chǎn)生類似效應(yīng)的藥物，在等輻射圖中來分析它們之間的相互作用[3]。本課題主要利用荔枝副產(chǎn)物荔枝皮，主要是荔枝皮中含有的豐富原花青素，來研究其抗氧化性，及其與VC、VE的協(xié)同抗氧化作用，為復(fù)合抗氧化劑的研究提供理論參考。對荔枝副產(chǎn)物加以利用不僅可以提高農(nóng)民收入，還可以變廢為寶，取得良好的經(jīng)濟效益和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝品種為妃子笑(Litchi chinensisSonn. cv.Feizixiao)，采自廣州市，成熟后采收并立即運回實驗室冷藏。

AB-8大孔吸附樹脂 南開大學(xué)化工廠；DPPH自由基 美國Sigma公司；VC、VE 中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙醇和硫酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FuheHH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；SH2-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；X-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海愛朗儀器有限公司；UV-9100紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 荔枝皮原花青素(LPPC)提取方法

取一定量預(yù)先準備的荔枝果皮，用80%乙醇溶液按照料液比1∶20(m/V)混合均勻，50℃恒溫水浴鍋中提取120min，收集濾液進行真空抽濾，得到樣品粗提液。濾液過樹脂吸附柱AB-8，用水洗下不被吸附的雜質(zhì)，用含80%乙醇沖洗樹脂吸附柱，收集乙醇洗脫液后減壓蒸餾得到的濃縮液，經(jīng)冷凍干燥后，得到荔枝皮原花青素的樣品粉末，純度為87.45%[4]。

1.3.2 荔枝皮原花青素清除DPPH自由基的IC50值及清除率的計算

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，通過在515nm波長處檢測荔枝皮原花青素對DPPH自由基的清除效果，計算其抗氧化能力，并計算出自由基清除率為50%時的自由基清除劑的質(zhì)量濃度，即IC50為半數(shù)抑制率質(zhì)量濃度。取不同稀釋度的提取液2mL和2×10-4mol/L的DPPH自由基甲醇溶液2mL，加入同一具塞試管中，搖勻，在室溫避光反應(yīng)30min后于515nm波長處測其吸光度，空白組以等體積無水乙醇代替DPPH自由基溶液，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，計算荔枝皮原花青素、VC和VE對DPPH自由基的清除率[5]。

式中：A0為對照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

1.3.3 Isobologram分析法研究荔枝皮原花青素與VC、VE的相互作用

以VC和VE單獨作用的IC50值的比值作為參考，選擇荔枝皮原花青素和VC的固定比(質(zhì)量濃度比)例定為3∶1、1∶1、1∶3，荔枝皮原花青素和VE的固定比例定為1∶1、1∶3、1∶9，按固定比例混合后，以同樣的方法測定復(fù)合抗氧化劑對DPPH自由基的清除作用，計算清除率及復(fù)合組的IC50值。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析

固定比例法除了從Isobologram圖做直觀判斷外，還可以進行統(tǒng)計學(xué)分析。首先計算理論上的復(fù)配組IC50add值。

式中：R為A、B兩種抗氧化劑單獨應(yīng)用時的效價比，即R=IC50A/IC50B；P1為抗氧化劑A在復(fù)配組中所占的比例；P2為抗氧化劑B在復(fù)配組中所占的比例，P2=1－P1。由實驗可以得到復(fù)配組實際的IC50mix值，采用t檢驗對理論上的IC50add和實驗得到的IC50mix進行統(tǒng)計比較，確定是否有顯著性差異，若IC50mix值小于IC50add值，表示相互作用為協(xié)同作用[6-7]。

再計算相互作用指數(shù)(γ)，常用其來評價協(xié)同或拮抗作用的程度。

IC50Amix、IC50Bmix分別為復(fù)配組中A、B兩種抗氧化劑的IC50值；IC50A、IC50B分別為A、B兩種抗氧化劑單獨作用時的IC50值。若γ=1，表示相互作用為相加；若γ＜1，表示相互作用為協(xié)同作用，γ值越小說明協(xié)同作用越強；若γ＞1，表示相互作用為拮抗作用[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝皮原花青素、VC、VE清除DPPH自由基能力的比較

圖1 不同抗氧化劑清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of different antioxidants

由圖1可知，荔枝皮原花青素、VC、VE都有清除DPPH自由基的能力，隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率也逐漸增加，且當質(zhì)量濃度達到一定數(shù)值后，清除率趨于穩(wěn)定。當荔枝皮原花青素的質(zhì)量濃度達到20mg/L時，可達到90%以上的清除率。荔枝皮原花青素、VC、VE的IC50值分別為9.98、9.21、27.96mg/L，清除DPPH自由基的能力依次為VC＞荔枝皮原花青素＞VE，表明荔枝皮原花青素有較強的清除自由基能力，即抗氧化活性較高。

2.2 Isobologram分析法評價荔枝皮原花青素與VC、VE的相互作用

2.2.1 荔枝皮原花青素與VC、VE復(fù)配后清除DPPH自由基能力的測定

從荔枝皮原花青素、VC、VE清除DPPH自由基的實驗中可以得到，荔枝皮原花青素與VC 的IC50值比率為1∶0.92，荔枝皮原花青素與VE的IC50值比率為1∶2.80。選擇3組固定比例，荔枝皮原花青素和VC的固定比例定為3∶1、1∶1、1∶3，荔枝皮原花青素和VE的固定比例定為1∶1、1∶3、1∶9，每組固定比例中的質(zhì)量濃度選擇應(yīng)在10～100g/100mL范圍內(nèi)均勻分布為宜。按固定比例混合后，以同樣的方法測定復(fù)合抗氧化劑對DPPH自由基的清除作用(表1)；由表1計算出荔枝皮原花青素與VC、VE組成的復(fù)配抗氧化劑對DPPH自由基的清除作用的 IC50值(表 2)。

表2 LPPC與VC、VE復(fù)配后清除DPPH自由基的IC50值Table 2 IC50 of LPPC combined with VC or VE against DPPH radicals

2.2.2 荔枝皮原花青素與VC、VE復(fù)配后的 Isobologram分析圖

根據(jù)(表2)所測得的IC50值標繪在Isobologram分析圖上(圖2)，將DPPH自由基清除實驗中得到的荔枝皮原花青素IC50值和95%可信限標繪在橫軸上，VC和VE的IC50值和95%可信限標繪在縱軸上，將兩IC50值相連后構(gòu)成相加線，將兩可信限分別相連后作出相加線95%可信限。如果復(fù)合原花青素效應(yīng)(復(fù)配點IC50)落在相加效應(yīng)線上或可信限內(nèi)，則表示兩藥作用為相加；如落在相加效應(yīng)線的可信限左側(cè)，則代表協(xié)同作用；如落于右側(cè)，則為拮抗作用[9]。由圖2可知，復(fù)配組的效應(yīng)點均落在相加線和95%可信限的下方(左側(cè))，表明荔枝皮原花青素與VC、VE復(fù)配后有協(xié)同抗氧化作用。

圖2 LPPC和VC、VE復(fù)配的Isobologram分析圖Fig.2 Isobolographic plot of LPPC combined with VC or VE

表1 LPPC與VC、VE復(fù)配后清除DPPH自由基的能力Table 1 DPPH radical scavenging capacity of LPPC combined with VC or VE

2.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

按1.3.4節(jié)所述方法及相應(yīng)公式計算復(fù)配組理論上的IC50add值和相互作用指數(shù)γ，對理論IC50add值和實驗IC50mix值在95%置信區(qū)間進行t檢驗，結(jié)果見表3。

表3 荔枝皮原花青素與VC、VE復(fù)配后的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果Table 3 Antioxidant effects of LPPC combined with VC or VE

由表3可出，各種組合的IC50mix值均小于IC50add值，經(jīng)過t檢驗證明兩者之間有顯著性差異，且相互作用指數(shù)γ都小于1，表明荔枝皮原花青素與VC、VE的相互作用是協(xié)同作用。γ值越小說明協(xié)同作用越強，由此可得荔枝皮原花青素與VE復(fù)配組的協(xié)同作用比荔枝皮原花青素與VC復(fù)配組更為顯著，尤其是1∶1和1∶3配比的協(xié)同作用更好，荔枝皮原花青素與VE復(fù)配組中協(xié)同作用的強弱順序為1∶1＞1∶3＞1∶9，荔枝皮原花青素與VC復(fù)配組中協(xié)同作用的強弱順序為1∶1＞3∶1＞1∶3。

3 結(jié) 論

Isobologram分析法是國外常用于判斷藥物之間相互作用的方法，被看作是評價藥物相互作用的“黃金標準”[10]。Isobologram分析法能簡單有效地評價抗氧化劑之間的相互作用，相互作用指數(shù)能為抗氧化劑的最佳配比提供理論依據(jù)[11]。本實驗主要從研究方法學(xué)角度進行了探索，采用將DPPH自由基清除實驗與Isobologram分析法相結(jié)合，比較了荔枝皮原花青素和VC、VE添加比例對其相互作用的影響，結(jié)果顯示，復(fù)配后有協(xié)同抗氧化作用，按不同比例進行復(fù)配得到的協(xié)同抗氧化作用程度存在明顯差異，且荔枝皮原花青素與VE復(fù)配組的協(xié)同作用強于荔枝皮原花青素與VC復(fù)配組。這將為復(fù)合抗氧化劑的使用提供參考依據(jù)。不過復(fù)合抗氧化劑的最佳配比還需根據(jù)相互作用指數(shù)進一步探究和確定，從而優(yōu)化復(fù)配方案，減少抗氧化劑的用量、節(jié)約成本，更好地指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。荔枝皮原花青素與VC、VE協(xié)同作用的機理還不清楚，有待進一步研究。

[1] KOHLER N, WRAY V, WINTERHALTER P. Preparative isolation of procyanidins from grape seed extracts by high-speed counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1177∶ 114-125.

[2] 郝曉麗. 七種抗氧化劑單一抗氧化活性及其協(xié)同作用的研究[D]. 青島∶ 青島大學(xué), 2002.

[3] 陳鴻, 潘寧玲, 王國林. 等輻射分析法的原理及應(yīng)用[J]. 國外醫(yī)學(xué),2004, 25∶ 267-269.

[4] 周瑋婧, 孫智達, 謝筆鈞, 等. 荔枝皮原花青素的提取、純化及抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(8)∶ 68-71.

[5] RAMADAS D, LEELA S. Antioxidant and free radical scavenging activities of polyphenol-enriched curry leaf (Murraya koenigiiL.) extracts[5]. Food Chem, 2008, 106∶ 720-728.

[6] 劉瑾, 邱海霞, 梅興國. 等高線圖解分析法∶ 評價藥物相互作用的方法[J]. 國外醫(yī)學(xué)∶ 藥學(xué)分冊, 2006, 33(6)∶ 459-461.

[7] QIU Haixia, LIU Jin, KONG Hui, et al. Isobolographic analysis of the antinociceptive interactions betwee ketoprofen and paracetamol[J]. European Journal of Pharmacology, 2007, 557∶ 141-146.

[8] RONALD J T. The interaction index∶ a measure of drug synergism[J].Pain, 2002, 98∶ 163-168.

[9] 肖黎波. 全身麻醉誘導(dǎo)時丙泊酚、咪噠哇侖之間相互作用及與BIS的相關(guān)問題探討[D]. 長沙∶ 中南大學(xué), 2007.

[10] MIRANDA H F, PRIETO J C, PUIG M M, et al. Isobolographic analysis of multimodal analgesia in an animal model of visceral acute pain[J]. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2008, 88∶ 481-486.

[11] BOROWICZ K K, JASZCZYK B, LUSZCZKI J J, et al. Interactions between two enantiomers of losigamone and conventional antiepileptic drugs in the mouse maximal electroshock model∶ an isobolographic analysis[J]. European Journal of Pharmacology, 2007, 567∶ 110-116.

Synergistic Antioxidant Effects of Procyanidins fromLitchi chinensisPericarp and VC or VE

ZHOU Wei-jing1,2，SUI Yong1，SUN Zhi-da1,* ，XIE Bi-jun1
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2.Wuhan Institute for Food and Drug Control, Wuhan 430012, China)

In order to explore the synergistic antioxidant effects of procyanidins fromLitchi chinensispericarp (LPPC) and vitamin C (VC) or vitamin E (VE), the antioxidant capacity of LPPC in the presence of VC or VE was evaluated by DPPH radical scavenging assay coupled with isobologram method. The results indicated that the IC50 of LPPC, VC and VE were 9.98, 9.21mg/L,and 27.96 mg/L, respectively, which suggested that LPPC had significant DPPH radical scavenging effect. The effect-response points of LPPC combined with VC or VE were observed below the addition line with 95% confidence interval in isobolographic plots. Meanwhile, a significant difference between theoretical IC50add value and experimental IC50mix value was achieved. The interaction index of each combination was less than 1. These findings indicate that there is a synergistic antioxidant effect between LPPC and VC or VE, which will reveals promising prospects in practical applications.

procyanidins fromLitchi chinensispericarp (LPPC)；antioxidation；isobologram；synergistic effect

TS201.1

A

1002-6630(2012)03-0005-04

2011-03-19

國家自然科學(xué)基金-廣東省聯(lián)合基金項目(U0731005)

周瑋婧(1985—)，女，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：elfinlife221@163.com

*通信作者：孫智達(1962—)，男，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：sunzhida@sina.com