絨毛狀煙草BAC文庫的構建

高曉明，陳艷玲，劉貫山，李鳳霞，王衛(wèi)峰，任媛媛，孫玉合*

（1.中國農業(yè)科學院煙草研究所，農業(yè)部煙草生物學與加工重點實驗室，青島 266101；2.華大基因研究院，深圳 518083）

近年來，越來越多物種的全基因組已被測序。此為重要基因的克隆、系統進化和基因組學研究提供了堅實的平臺。構建細菌人工染色體文庫（BAC）是全基因組測序的一個重要環(huán)節(jié)[1-2]。BAC文庫具有插入片段大、嵌合率低、遺傳穩(wěn)定性好、易于操作等優(yōu)點而備受青睞。目前已經在棉花[3-4]、水稻[5-6]、玉米[7]、大豆[8-9]、高粱[10]、黍[11]和番茄[12]等作物中建立了BAC文庫，為測序、基因圖位克隆、分子標記、物理作圖、基因結構和調控等研究提供了一個重要的技術平臺。建立絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis）的BAC基因組文庫，對煙草基因功能、次級代謝途徑的研究等均有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草材料為中國農業(yè)科學院煙草研究所基地種植的絨毛狀煙草。BAC克隆載體采用Epicentre公司的 CopyControlTMBAC Cloning Kit(Hind III)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞核 DNA 的制備 -80 ℃冷凍保存的嫩葉50 g，液氮研磨約30 min至粉末狀，加入500 mL預冷的NIBM（10% TKE，1 mM spermidine，1 mM spermine，0.2%β-巰基乙醇），間歇性輕輕攪拌約15 min。先后用4層紗布和1層miracloth過濾；濾液中加入 1/40體積的 NIBT（10% TKE，1 mM spermidine，1mM spermine，20% Triton X-100），間歇性輕輕攪拌10 min，4 ℃ 2000 g 離心15 min；棄上清，用 50 mL預冷的 NIBM 重懸沉淀，兩層miracloth過濾，4 ℃ 2000 g 離心15 min。重復該操作5次。棄上清，用1 mL NIB（10% TKE，1 mM spermidine，1mM spermine）重懸沉淀，45 ℃水浴2～5 min，與用NIB配制的，并經45 ℃水浴的1.5%低熔點膠等體積混合。混勻后轉移至模具中，冰上放置30 min形成plugs。制備好的plugs轉移至50 mL離心管中，加入20 mL lysis buffer [0.5 M EDTA（pH 9.2），1% lauryl sarcosine，過濾滅菌，加入蛋白酶K至0.3 mg/mL，混勻，50 ℃水浴24 h。倒掉lysis buffer，重新加入新鮮的lysis buffer和蛋白酶K，50 ℃水浴 24 h。倒掉處理液，加入 1×TE（pH8.0），4 ℃冷庫震蕩30 min。倒掉處理液，加入1×TE（pH 7.6），4 ℃冷庫震蕩30 min。倒掉處理液，加入含0.2 mM PMSF的10 mL TE緩沖液（pH 7.6），室溫靜置30 min，重復該操作2次。加入50 mL TE緩沖液（pH 8.0），4 ℃冷庫震蕩30 min，重復該操作2次。plugs加入50 mL TE緩沖液（pH 8.0），4 ℃保存或用于酶切。

1.2.2 大片段DNA的獲得 按照1個plugs在3 mL buffer1（V1×HindⅢ buffer：V1M spermidine：V1M DTT= 3000：6：1）中4 ℃平衡2次，每次30 min的要求，平衡6個plugs。將每個plugs分割成等大的12份，將每4小份的plug加入裝有 buffer 2（1×HindⅢ buffer 170 μL；1 M spermidine 0.34 μL；1M DTT 0.17 μL，10 mg/mL BSA2 μL 和1.6 U的HindⅢ）的1.5 mL離心管中，共18管，冰上平衡1.5 h，37 ℃水浴8 min；加入1/10體積的0.5 M EDTA（pH8.0），4 ℃放置30 min；脈沖場電泳進行膠回收，電泳分為2個Block。Block1：起始脈沖時間90 s，終止脈沖時間90 s，溫度12.5 ℃，角度120°，電壓6 V/cm，電泳時間14 h；Block2：起始脈沖時間5 s，終止脈沖時間5 s，溫度12.5 ℃，角度120°，電壓4 V/cm，電泳時間2 h。電泳結束后切下100～150 kb部分和150～200 kb部分。所得膠條經透析后進行二次脈沖場凝膠電泳，電泳條件為起始脈沖時間5 s，終止脈沖時間5 s，溫度12.5 ℃，角度120°，電壓4 V/cm，電泳時間14 h。切膠回收，脈沖電泳透析，將透析袋中溶液用于連接。

1.2.3 大片段DNA與BAC載體的連接與轉化 連接體系如下：DNA12.5 μL（25 ng），載體 0.75 μL（18.75 ng），純化水8.5 μL，混勻，55 ℃ 10 min，RT 15 min，再加入 10×Ligase Buffer2.5 μL，100 mM ATP0.25 μL，2 U/μL Fast link ligase 0.5 μL，16 ℃連接16 h；連接液中加入0.4 μL 0.5 M EDTA（pH8.0）和 0.4 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K，混勻，37 ℃水浴1 h；加入0.4 μL 100 mM PMSF，混勻，RT 1h；將連接液點在0.025 μm Millipore膜中間，置于含冰冷純化水的平皿中，脫鹽2 h。將2 μL連接產物和20 μL感受態(tài)細胞EPI 300混勻，電擊轉化，吸出轉化液，迅速加入900 μL SOC液體培養(yǎng)基，吸打混勻；搖床180 rpm，37 ℃復蘇60 min。取300 μL復蘇液均勻的涂布在LB（用前涂100 μL VX-gal：VIPTG= 1：4混合液）上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2.4 BAC單克隆插入DNA片段大小的鑒定 隨機挑取單克隆，分別接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基，200 rmp，37 ℃，震蕩培養(yǎng)過夜，提取質粒DNA，Not I酶切后進行脈沖場電泳檢測，電泳條件為：起始脈沖時間0.1 s，終止脈沖時間40 s，溫度14 ℃，角度120°，電壓6 V/cm，電泳時間14 h。計算平均插入片段和空載率。

1.2.5 單克隆的挑取與保存 取白斑，接種于含有凍存緩沖液的細菌培養(yǎng)板中，37 ℃，培養(yǎng)16 h，用鋁箔封好，-80 ℃保存。

2 結 果

2.1 高質量高濃度細胞核DNA的制備

高效連接的 BAC克隆很大程度上取決于核DNA包埋膠塊plug中核DNA的濃度和純度。由于煙草葉片組織中含有較多的酚類等次級代謝產物，大大降低了細胞核DNA質量，因此本試驗選用煙草幼嫩組織為材料來制備高分子量DNA，幼嫩組織代謝產物少。制備細胞核 DNA時按照常規(guī)方法NIBM溶液中β-巰基乙醇的濃度為0.15%，攪拌10 min，制備出的plug顏色為微微的乳黃色，半透明，說明仍含有來自葉片的酚類物質以及細胞壁殘渣，這些殘留的物質會降低后續(xù)酶切的消化效率。因此試驗中將β-巰基乙醇的濃度調整為0.2%，攪拌15 min，制備出的plug為無色透明，這說明得到的核DNA比較純凈，提高了核DNA的質量。

2.2 BAC文庫的質量檢測

2.2.1 插入片段大小分析 用限制性核酸內切酶HindIII，對包埋的煙草高分子量核DNA進行消化，通過調節(jié)酶切時間及酶濃度，就可以獲得長度適合建庫的高分子量核 DNA。在進行大規(guī)模的酶切之前，先通過小范圍的酶切試驗確定最佳的酶切時間和酶濃度。隨機挑取100個單克隆，提其質粒并酶切鑒定插入片段大小。結果表明：插入片段分布在50～200 kb之間，平均插入片段約為110 kb，空載率＜2%（圖1）。

圖1 插入片段Not I酶切檢測Fig.1 PFGE analysis of insert size of the randomly picked clones

2.2.2 BAC克隆穩(wěn)定性分析 隨機挑取15個BAC單菌落，連續(xù)培養(yǎng)100代；提取第0代和第100代的BAC質粒DNA，分別進行EcoR?酶切，進行脈沖場電泳檢測。結果表明，經繼代培養(yǎng)后，BAC克隆的酶切帶形一致（圖2）。說明BAC克隆中的插入片段至少可以穩(wěn)定遺傳100代。

圖2 繼代穩(wěn)定性EcoR?酶切檢測Fig.2 Stability analysis of BAC clones

3 討 論

煙草作為重要的經濟作物，在農業(yè)經濟和國際貿易中占有重要地位。目前生產上應用最普遍、經濟價值最大的栽培種普通煙草[Nicotiana tabacum(SSTT，2n=4X=48)]，是由林煙草[N.sylvestris (SS，2n=24) ]和絨毛狀煙草(TT，2n=24)種間雜交形成的一個不育的雜交種，經染色體加倍后形成的可育異源四倍體，進化成為現在的商業(yè)化栽培種。絨毛狀煙草是普通煙草的原始親本之一，基因組大小約為 2300 M。在確定絨毛狀煙草的全基因組序列后，可以更加方便地確定其它煙草屬內其它種的基因組序列，從而掌握普通煙草及其近緣野生種的完整序列信息。

目前大片段文庫構建技術已經十分成熟，但是相對于普通文庫的構建來說，依然存在技術上的難點。高質量高濃度的細胞核DNA插入片段的制備是 BAC文庫能否構建成功的最基本條件。植物材料的選取直接影響細胞核的質量。本試驗所用材料取自田間幼嫩葉片，葉綠體含量低，酚類及其它次級代謝產物含量低，很好地保證了試驗所需細胞核的質量。為減少提取過程中細胞核的物理損傷和防止高分子量DNA的物理打斷，植物組織研磨不能太細，包埋細胞核的操作及酶切、連接的操作必須動作輕柔，使用廣口槍頭。

高分子量的大小均一的插入片段是構建 BAC文庫最關鍵的環(huán)節(jié)之一[13-14]，設計一系列小規(guī)模酶切試驗以確定最佳酶切時間和酶濃度是十分重要的。Karutoyo等[15]的研究結果表明，如果酶用量過大可能導致非特異性酶切，這種非特異性酶切雖然在整個酶切反應體系中發(fā)生的幾率很小，但結果卻會產生很高比例的假陽性，從而導致整個文庫的空載率過高。

在連接反應中，盡量避免在插入片斷中混有小片段。片段太小建庫的重復次數、克隆保存數等就會增加很多。片段太大會降低連接轉化效率。

轉化反應也是重要步驟之一。整個轉化過程越快越好，操作要熟練，動作越快轉化效率越高。同時，轉化環(huán)境要求低離子強度，故在連接反應之后要對連接產物進行脫鹽處理。Allouis等[16]的試驗表明，轉化條件是影響大片段基因組文庫插入片段大小的關鍵因素。BAC載體理論上可以攜帶 300 kb的外源基因片段，但現在所有的 BAC文庫平均插入片段在150 kb左右，可見優(yōu)化目前的轉化條件以提高插入片段的大小是急需解決的問題。

本試驗成功地構建了絨毛煙草 BAC文庫，為進一步克隆重要功能基因提供了必備的物質平臺。

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