白藜蘆醇對(duì)大鼠糖尿病性白內(nèi)障抗氧化損傷的保護(hù)作用△

鐘曉東 羅衛(wèi)民 劉越峰 余錦強(qiáng) 李 凌 王 瑩 李玉霞

白內(nèi)障是世界上首位致盲因素，全球約1700萬(wàn)人因白內(nèi)障而致盲，也是我國(guó)第一位致盲性眼?。?］。糖尿病是白內(nèi)障的最主要誘發(fā)因素之一，隨著研究的深入，氧化損傷在糖尿病性白內(nèi)障中的作用已經(jīng)日益受到重視［2］。白藜蘆醇是一類非黃酮類多酚化合物，已有研究發(fā)現(xiàn)它具有強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基能力［3］。本研究試圖建立大鼠鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)糖尿病性白內(nèi)障模型，研究白藜蘆醇對(duì)糖尿病性白內(nèi)障小鼠晶狀體組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)等酶活性及銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn superoxide dismutase，CuZnSOD)基因表達(dá)水平的影響，從而為糖尿病性白內(nèi)障的防治尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SD大鼠90只由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，體質(zhì)量(250±5)g，散瞳檢查結(jié)果顯示晶狀體透明，并隨機(jī)分為3組(每組各30只)，A組:正常對(duì)照組;B組:糖尿病模型組;C組:白藜蘆醇治療組。白藜蘆醇和STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(純度分別＞99%、98%)，兔抗鼠CuZnSOD多克隆抗體為武漢博士德公司產(chǎn)品。Tag酶購(gòu)自英國(guó)Biolabs公司。Trizol和DNA Marker購(gòu)自美國(guó)Promega公司，SOD試劑盒、CAT試劑盒以及GSH-PX試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。其他生化試劑主要為上海生物工程有限公司分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠動(dòng)物模型的建立及白藜蘆醇干預(yù)［4］A組大鼠給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，B組、C組大鼠一次性腹腔注射10 g·L－1STZ 溶液(0.1 mol·L－1檸檬酸鹽緩沖液稀釋，pH 4.5)，72 h后尾靜脈取血，當(dāng)空腹血糖＞14 mmol·L－1表示糖尿病模型建立成功。C組大鼠按400 mg·kg－1體質(zhì)量給予白藜蘆醇灌胃，12周后采用10 g·L－1戊巴比妥鈉麻醉并無(wú)菌條件下處死大鼠，獲取晶狀體用于以下研究。

1.2.2 晶狀體混濁度的觀察 大鼠雙眼經(jīng)10 g·L－1托品酰胺滴眼液滴眼后，乙醚蒸汽麻醉。用裂隙燈觀察晶狀體變化情況。晶狀體混濁程度參考文獻(xiàn)

［5］進(jìn)行分級(jí):Ⅰ級(jí):無(wú)混濁，晶狀體清亮透明;Ⅱ級(jí):輕度混濁，晶狀體周邊有少量空泡;Ⅲ級(jí):中度混濁，空泡擴(kuò)散至中心區(qū)域，晶狀體核出現(xiàn)霧狀混濁;Ⅳ級(jí):晶狀體高度混濁，周邊空泡擴(kuò)展到核區(qū)，核霧狀混濁進(jìn)一步加重;Ⅴ級(jí):核混濁，完全性白內(nèi)障。

1.2.3 SOD、GSH-PX以及CAT活性檢測(cè) 獲取的大鼠晶狀體經(jīng)生理鹽水漂洗后加入9倍晶狀體質(zhì)量的勻漿介質(zhì)(pH 7.4，含 10 mmol·L－1Tris、0.1 mmol·L－1EDTA、10 mmol·L－1蔗糖、8 g·L－1NaCl)，制成勻漿，4 ℃ 下 14 000 r·min－1離心 10 min，取上清用于SOD、GSH-PX以及CAT活性檢測(cè)。黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法和鉬酸銨-化學(xué)比色法分別檢測(cè)SOD、GSH-PX和CAT活性。操作步驟按試劑盒提供的方法進(jìn)行。

1.2.4 晶狀體 CuZnSOD 基因表達(dá)(RT-PCR)的檢測(cè) 用Trizol試劑提取晶狀體RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。25 μL反應(yīng)體系中含有:10×Tag緩沖液2.5 μL、25 mmol·L－1MgCl21.5 μL、2.5 mmol·L－1dNTP 2 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 模板2 μL、重蒸水 14.75 μL、Tag 酶 0.25 μL。94 ℃預(yù)變性 3 min后，進(jìn)入31個(gè)循環(huán):96℃ 50 s、55℃ 50 s、70℃ 50 s，最后72℃延伸10 min。所用引物序列如下:CuZnSOD上游引物:5’-TGGTGGGCAGACGACTAA-3’、下游引物:5’-AAGATGGATGCTCGGTGTAA-3’，產(chǎn)物 578bp;β-actin 上 游 引 物:5’-ACCGTGGAGAAGAGCTACGA-3’、下 游 引 物:5’-GTACTTGCGCTCAGAAGGAG-3’，產(chǎn)物309 bp。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，拍照后灰度掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次，計(jì)量資料采用±s表示，晶狀體混濁度比較用H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi分析。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠血糖、體質(zhì)量觀察 分別于灌注后4周、8周、12周測(cè)量3組大鼠體質(zhì)量，結(jié)果顯示:糖尿病模型組大鼠體質(zhì)量明顯低于正常對(duì)照組和白藜蘆醇治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而白藜蘆醇治療組和正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。STZ注射3 d后，大鼠血糖均 ＞14 mmol·L－1。灌注后4周、8周、12周，3組大鼠血糖兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中白藜蘆醇治療組血糖低于糖尿病模型組，但略高于正常對(duì)照組(P ＜0.05)。

2.2 晶狀體混濁度檢測(cè) 3組大鼠不同時(shí)間晶狀體混濁度見(jiàn)表1所示，正常對(duì)照組大鼠在4～12周內(nèi)始終透明。灌注后12周糖尿病模型組大部分晶狀體核及核周皮質(zhì)均出現(xiàn)混濁或完全混濁，3組大鼠晶狀體的混濁度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Hc=34.57，P＜0.05)。其中白藜蘆醇治療組晶狀體混濁度高于正常對(duì)照組(χ2=8.26，P ＜0.05)，但與糖尿病模型組相比明顯減輕(χ2=14.72，P ＜0.05)。

表1 4～12周內(nèi)3組大鼠晶狀體混濁程度比較Table1 Comparison of opacity degree among the three groups from 4 weeks to 12 weeks (rats)

2.3 晶狀體內(nèi)SOD、GSH-PX及CAT活性的變化

糖尿病模型組晶狀體內(nèi)SOD、GSH-PX和CAT活性分別為(10.39 ±1.25)U·mg－1、(24.36 ±1.05)U·mg－1和(1.62 ±0.24)U·mg－1，均低于正常對(duì)照組(40.16 ±1.87)U·mg－1、(67.86 ±1.24)U·mg－1、(5.57 ±1.54)U·mg－1(均為 P ＜0.05)。白藜蘆醇治療組晶狀體內(nèi)SOD、GSH-PX和CAT活性分別為(29.06 ±1.33)U·mg－1，(47.58 ±2.35)U·mg－1和(3.26 ±0.47)U·mg－1，與糖尿病模型組相比，3種酶活性有所增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。

2.4 CuZnSOD mRNA表達(dá)變化 3組大鼠晶狀體內(nèi)CuZnSOD mRNA表達(dá)變化見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn):正常對(duì)照組大鼠晶狀體內(nèi)CuZnSOD mRNA呈高水平表達(dá)，當(dāng)腹腔注射STZ后，CuZnSOD mRNA表達(dá)水平顯著降低(t=8.44，P＜0.05)。而白藜蘆醇能有效提高糖尿病大鼠晶狀體內(nèi)CuZnSOD mRNA水平(t=6.97，P ＜0.05)。

Figure 1 The mRNA expression level of CuZnSOD in the three groups.1:Marker;2:Control group;3:Diabeticmodel group;4:Resveratrol group 3組大鼠晶狀體內(nèi)CuZnSOD mRNA表達(dá)水平。1:Marker;2:正常對(duì)照組;3:糖尿病模型組;4:白藜蘆醇治療組

3 討論

糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前的觀點(diǎn)主要包括滲透壓學(xué)說(shuō)、蛋白質(zhì)糖基化學(xué)說(shuō)和氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)［6］。氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)認(rèn)為，糖尿病發(fā)生時(shí)，血糖的自氧化、多元醇途徑以及蛋白糖基化等能顯著增加氧自由基的產(chǎn)生［7］。生理?xiàng)l件下，晶狀體具有兩道抗氧化屏障:第1道包括谷胱甘肽、抗壞血酸以及維生素E，其功能主要是保護(hù)晶狀體蛋白中巰基功能，還原H2O2和其他氧化物;第2道防線是晶狀體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，主要包括GSH-PX、CAT、SOD及其同工酶CuZnSOD等。自由基的生成-降解平衡的異常是引起白內(nèi)障的共同途徑，它能與細(xì)胞膜中的聚不飽和脂肪酸相互作用，從而影響細(xì)胞膜的通透性，并引起Na+泵、Ca2+泵功能失調(diào)［8-9］。隨后，自由基與晶狀體蛋白氨基酸中的巰基反應(yīng)，使之發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致蛋白變性并發(fā)生肉眼可見(jiàn)的混濁。

自從上世紀(jì)40年代以來(lái)，白藜蘆醇一直頗受醫(yī)學(xué)界的重視，尤其是其抗氧化與自由基能力尤為突出，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能清除多種活性氧簇［10］。Cu-白藜蘆醇復(fù)合物能夠在生理pH值范圍內(nèi)發(fā)揮類似SOD的作用。但目前關(guān)于白藜蘆醇對(duì)糖尿病性白內(nèi)障的防治作用的研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠具有一定的降血糖作用，并在相應(yīng)的時(shí)間內(nèi)能有效改善晶狀體的混濁程度。同時(shí)我們通過(guò)對(duì)晶狀體中抗氧化的關(guān)鍵物質(zhì)GSH-PX、CAT和SOD，以及CuZnSOD mRNA水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠中GSH-PX、CAT和SOD的活性顯著下降，而白藜蘆醇能部分維持晶狀體的氧化還原狀態(tài)，甚至逆轉(zhuǎn)抗氧化酶類活性的降低，同時(shí)白藜蘆醇能增強(qiáng)CuZnSOD的轉(zhuǎn)錄。這可能與直接清除活性氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用、保護(hù)與激活抗氧化酶、抑制氧化酶有關(guān)?？傊狙芯繌木铙w的形態(tài)學(xué)、酶學(xué)等方面研究了白藜蘆醇全身性給藥對(duì)糖尿病大鼠晶狀體的保護(hù)作用，證實(shí)了其具有一定的抗氧化酶活性，因此有望成為糖尿病性白內(nèi)障治療的一種潛在藥物，但其確切的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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