色甘酸鈉對(duì)缺血再灌注兔心室肌電生理特性的影響

李海濤

色甘酸鈉由于其具備穩(wěn)定肥大細(xì)胞胞膜的藥物特性而被廣泛應(yīng)用于變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療中。與經(jīng)典的RAS系統(tǒng)不同，肥大細(xì)胞所產(chǎn)生的AngⅡ主要作用于周邊局部受體，其主要分布在心臟、大腦及眼球等器官。近期研究表明由于藥理特性其可能使其具有潛在的抗缺血再灌注心律失常作用。近年來(lái)研究表明肥大細(xì)胞可以在多種因素刺激下合成及分泌腎素并依賴(lài)自身內(nèi)源性蛋白酶將其轉(zhuǎn)化為血管緊張素［1］。存在于心臟間質(zhì)中的肥大細(xì)胞由于解剖上鄰近神經(jīng)細(xì)胞及心肌細(xì)胞使其易于通過(guò)各種方式將所生成的化學(xué)產(chǎn)物作用于相鄰細(xì)胞，從而引起相應(yīng)細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)上的改變［2］。目前對(duì)該藥的研究熱點(diǎn)集中在其抑制慢性心力衰竭、高血壓及心肌病的長(zhǎng)期效應(yīng)如血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及心內(nèi)膜纖維化領(lǐng)域。Mackins等通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑能夠有效抑制缺血再灌注心律失常的發(fā)生，其機(jī)制可能與抑制局部血管緊張素的生成有關(guān)［3］。但目前對(duì)于這種抗心律失常效應(yīng)是否具有電生理學(xué)上的改變尚無(wú)明確的結(jié)論。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:選取成年新西蘭大耳白兔40只，雌雄不拘，體重約在2～3kg之間，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分入對(duì)照組及3種不同濃度藥物處理組。

2.動(dòng)物模型的制備:以30mg/kg戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉及1000IU肝素抗凝20min后，迅速取出心臟置于100%氧飽和的0℃無(wú)鈣臺(tái)式液中并迅速將自制管徑與主動(dòng)脈相近的灌流管與Langendorff灌流系統(tǒng)和主動(dòng)脈三者依次相連并切取帶有該段主動(dòng)脈的左心室前壁楔形肌塊，充分暴露其內(nèi)膜及外膜層，結(jié)扎其他主要滲漏血管后將標(biāo)本固定于灌流槽內(nèi)在36.0±0.5℃恒溫下恒速主動(dòng)脈逆行灌流。

3.灌流步驟:對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式液，不同處理組給予分別含不同濃度色甘酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式液灌流;其后所有樣本均貫序給予模擬缺血液和標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式液灌流以模擬缺血再灌注過(guò)程。

4.溶液配制:標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式液成分:129mmol/L NaCl，4mmol/L KCl，0.9mmol/L NaH2PO4，20mmol/L NaHCO3，1.8mmol/L CaCl2，0.5mmol/L MgSO4和 5.5mmol/L 葡萄糖;pH 7.35，充以95%的O2和5%的CO2。模擬缺血液成分:123mmol/L NaCl，12mmol/L KCl，1.2mmol/L NaH2PO4，6.0mmol/L NaH-CO3，1.8mmol/L CaCl2，0.6mmol/L MgCl2和20mmol/L 乳酸鈉;pH 6.8，充以95%的N2和5%的CO2。藥物處理組灌流液為標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式液基礎(chǔ)上分別加入10、50、100μmol/L色甘酸鈉。

5.電生理指標(biāo)測(cè)定:將拉制的尖端為 0.5μm，內(nèi)充3.0mmol/L KCl，阻抗為15～20MΩ玻璃微電極接觸并插入左心室楔形肌塊心內(nèi)膜及心外膜記錄，經(jīng)刺激儀發(fā)放波寬為2ms，輸出電壓為閾電壓兩倍強(qiáng)度的方波脈沖，由微電極引出細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位。將Ag/AgCl電極分別置于心肌塊兩側(cè)約1cm處記錄模擬心電圖。所有實(shí)驗(yàn)均在標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式液灌流穩(wěn)定1h后進(jìn)行。(1)刺激方式:程序電刺激分為S1S2刺激與快頻率S1S1刺激兩種形式:①S1S2刺激設(shè)置為S1∶S2=8∶1，S1S1間期定為1000ms，S1S2間期從200ms，步長(zhǎng)為10ms行負(fù)掃直至達(dá)到不應(yīng)期;②快頻率S1S1刺激設(shè)置為300ms起至200ms頻段以10ms步長(zhǎng)遞減，200ms直至100ms頻段以5ms連續(xù)發(fā)放刺激30s，每次切換刺激頻率間隔5s，連續(xù)刺激直至達(dá)到如下任何一種電生理現(xiàn)象出現(xiàn)為止:①達(dá)到不應(yīng)期或刺激呈2∶1激動(dòng)心室肌:②出現(xiàn)室性心動(dòng)過(guò)速、心室撲動(dòng)或心室顫動(dòng);③出現(xiàn)動(dòng)作電位電交替。(2)觀察指標(biāo):①M(fèi)AP復(fù)極90%的時(shí)程(MAPD90):MAP0期至復(fù)極達(dá)90%的時(shí)間;②APD動(dòng)態(tài)恢復(fù)曲線最大斜率:APD動(dòng)態(tài)恢復(fù)曲線用Origin 7.0軟件擬合，所用函數(shù)為:APD90=y0+A1(1-exp-DI/τ1)。

其中A1為自由擬合變量，每一組A1與τ1對(duì)應(yīng)于一個(gè)DI(舒張間期)值，最大斜率(Slopemax)由下列函數(shù)求得，函數(shù)公式為:Slopemax=(A/τ1)×［Exp(-DI/τ1)］

每個(gè)MAPD90值由連續(xù)測(cè)定的20個(gè)APD90求平均值得出，APD恢復(fù)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)中的APD與DI由每個(gè)刺激頻段的最后5個(gè)APD與DI值求平均值得出。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用Aknowledge 3.72軟件采集與測(cè)量APD數(shù)據(jù)，應(yīng)用Origin 7.0軟件擬和動(dòng)態(tài)恢復(fù)曲線并求出最大斜率。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間均數(shù)比較采用ANOVA檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分比表示，用χ2檢驗(yàn)和精確概率法統(tǒng)計(jì)以P＜0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1.室性心律失常誘發(fā)率:與對(duì)照組相比，在灌注時(shí)相各藥物處理組的室性心律失常誘發(fā)率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)(表1)。

表1 不同狀態(tài)下各組VT與VF誘發(fā)率(%，n=10)

2.動(dòng)態(tài)恢復(fù)曲線最大斜率的比較:在基礎(chǔ)狀態(tài)、藥物灌注期及缺血時(shí)相各藥物處理組的恢復(fù)曲線斜率與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異;再灌注時(shí)相，對(duì)照組恢復(fù)曲線斜率均＞1，各藥物處理組恢復(fù)缺陷斜率均＜1，二者之間的差異具有顯著性(P均＜0.05)(表2)。

表2 不同狀態(tài)下各組動(dòng)態(tài)恢復(fù)曲線最大斜率的比較(± s，n=10)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 基礎(chǔ)狀態(tài) 藥物灌注 缺血狀態(tài) 再灌注狀態(tài)對(duì)照組Endo 1.01±0.26 1.03±0.35 0.85±0.24 1.39±0.52 Epi 0.85±0.28 0.82±0.36 0.92±0.21 1.20±0.27 10μm 組Endo 0.98±0.47 1.01±0.58 0.95±0.28 0.93±0.53＊＊Epi 0.70±0.36 0.72±0.59 0.80±0.35 0.72±0.10＊＊50μm 組Endo 0.86±0.54 0.97±0.68 0.98±0.26 0.46±0.28＊＊Epi 0.78±0.52 0.62±0.46 0.86±0.21 0.99±0.30*100μm 組Endo 0.94±0.45 0.93±0.73 0.89±0.25 0.98±0.39*Epi 0.83±0.45 0.84±0.46 0.90±0.21 0.84±0.55*

討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過(guò)抑制肥大細(xì)胞源性AngⅡ?qū)?xì)胞游離鈣的調(diào)控作用從而影響心肌細(xì)胞的APD和恢復(fù)性質(zhì)可能是色甘酸鈉抑制缺血再灌注心律失常的機(jī)制之一。肥大細(xì)胞作為獨(dú)立于ACE系統(tǒng)之外的AngⅡ供源，由于分布特點(diǎn)其局部效應(yīng)遠(yuǎn)高于經(jīng)典ACE系統(tǒng)。Urata等發(fā)現(xiàn)心臟內(nèi)80%到90%的AngⅡ來(lái)源于這一途徑［3］。長(zhǎng)期高血濃度的AngⅡ可以促進(jìn)多種心律失?；|(zhì)的形成如心臟間質(zhì)膠增生所致內(nèi)膜纖維化，還可以引起室壁張力增加從而引起APD的縮短，ERP離散度增加和EAD發(fā)生。缺血狀態(tài)下，交感神經(jīng)末端釋放的神經(jīng)肽Y和去甲腎上腺素可以激活肥大細(xì)胞使其分泌腎素并轉(zhuǎn)化為AngⅡ，局部高濃度AngⅡ可以通過(guò)旁分泌的方式直接作用于周?chē)纳窠?jīng)細(xì)胞胞膜AT1受體引起兒茶酚胺，內(nèi)皮素的合成及促進(jìn)去甲腎上腺素從突觸前神經(jīng)末梢釋放入血，并進(jìn)一步介導(dǎo)AngⅡ生成。該過(guò)程表現(xiàn)為正反饋效應(yīng)［4～6］。此外，AT1受體廣泛分布于心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)，激活后可以產(chǎn)生如調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣操控、激活鈉氫交換體和PKC等一系列可以促進(jìn)自發(fā)性電活動(dòng)如EAD、DAD發(fā)生并增加傳導(dǎo)速度等［7］。

近年來(lái)多項(xiàng)研究均提出心臟興奮恢復(fù)性質(zhì)與室性心律失常的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，而心臟動(dòng)態(tài)恢復(fù)曲線在一定程度上可以代表室性心律失常發(fā)生過(guò)程中螺旋波折返性激動(dòng)的穩(wěn)定性和破碎波發(fā)生的趨勢(shì)。本研究中發(fā)現(xiàn)色甘酸鈉可以平復(fù)再灌注時(shí)相APD動(dòng)態(tài)恢復(fù)曲線的斜率，但是對(duì)缺血時(shí)相的斜率卻無(wú)顯著影響。推測(cè)色甘酸鈉的這種作用可能與其抑制肥大細(xì)胞源性AngⅡ生成的直接效應(yīng)或介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞胞膜鈉氫交換體釋放的神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的特殊操控有關(guān)，而在缺血狀態(tài)下，心肌細(xì)胞受缺血環(huán)境下低能量供給影響，細(xì)胞內(nèi)游離鈣下降從而導(dǎo)致其興奮性下降，故色甘酸鈉對(duì)缺血狀態(tài)下心臟恢復(fù)性質(zhì)的影響較小，而在再灌注時(shí)相，由于鈣超載使細(xì)胞內(nèi)鈣離子操控紊亂，該藥物作用才得以體現(xiàn)。而AngⅡ可以通過(guò)IP3途徑調(diào)節(jié)星狀神經(jīng)節(jié)交感神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平，該效應(yīng)使其具備在病理狀態(tài)下引起心律失常發(fā)生的基質(zhì)［8］。

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