牛肝菌對小鼠免疫功能影響的實驗研究

王 濤，李麗娟，申元英

（大理學院，云南大理 671000）

牛肝菌對小鼠免疫功能影響的實驗研究

王 濤，李麗娟，申元英*

（大理學院，云南大理 671000）

目的：探討牛肝菌對小鼠免疫功能的影響。方法：將牛肝菌的水溶液和脂溶液分別灌胃小鼠10 d，檢測小鼠免疫器官重量、巨噬細胞吞噬能力、T淋巴細胞增殖情況及細胞因子產(chǎn)生的情況。結(jié)果：牛肝菌脂溶組中小鼠的多數(shù)指標均高于水溶組；并且牛肝菌對雌性小鼠的免疫增強作用強于雄性小鼠。結(jié)論：牛肝菌有增強免疫功能及抗腫瘤的作用。

牛肝菌；免疫活性；小鼠

牛肝菌是一種在世界各地均廣泛分布的野生食用菌，因其野生子實體內(nèi)富含多種氨基酸、維生素、礦質(zhì)元素、蛋白質(zhì)、活性多糖等人體所需的營養(yǎng)成分，且香味濃郁，味道鮮美，深受人們喜愛〔1-2〕。目前，國內(nèi)外對于牛肝菌的研究眾多，主要集中于牛肝菌的抗氧化方面，如Kasuga等〔3〕研究了乳牛肝菌中抗氧化活性成分，國內(nèi)學者也對此進行了大量研究〔4〕。但對于牛肝菌增強機體免疫功能方面的研究較少。已有研究表明：牛肝菌可增強機體免疫功能〔5〕。因此，本文以云南野生牛肝菌的水提劑和醇提劑為受試藥物，通過連續(xù)灌胃小鼠10 d后，檢測其免疫功能。旨在探討牛肝菌醇提取物對小鼠免疫功能的影響。

1 材料和方法

1.1 受試藥品由大理學院藥學院藥物研究所提供，提取率為21%，使用冷凍法干燥。

1.2 實驗動物昆明種小鼠由昆明醫(yī)科大學動物中心提供，共計140只，雌雄各半，4~6周齡，體重18~ 22 g。實驗動物許可證號：scxk（滇）2005-0008。

1.3 主要儀器和試劑連續(xù)波長酶標儀（PowerwaveXS，美國），CO2培養(yǎng)箱（SANYO，日本），二甲基亞砜（DMSO，天津市風船化學試劑科技有限公司，批號：070707）；注射用環(huán)磷酰胺（CTX）（山西普德藥業(yè)有限公司，批號：20100307）；小牛血清（北京奧博星生物技術責任有限公司，批號：20100303）；RPMI-1640（Invitrogen公司，批號：1313945）；植物血凝素PHA（Solarbio Life sciences，批號：P8090）；四噻唑鹽（MTT，Sigma公司）；Mouse IL-2 ELISA檢測試劑盒（Quantikine，批號：281038）；Mouse TNFαELISA檢測試劑盒（Quantikine，批號：282254）。

1.4 實驗分組牛肝菌（NGJ）樣品溶解時使用超純水（ddH2O）和二甲基亞砜兩種溶劑；環(huán)磷酰胺、二甲基亞砜和超純水組為陰性對照組；實驗中NGJ含量為200 mg/kg，CTX含量為40 mg/kg，DMSO含量20 mL/kg，ddH2O含量為20 mL/kg。采用隨機區(qū)組法，按性別將140只小鼠分為14個小組，分別用A-N表示，每組10只。具體分組見表1。

表1 牛肝菌對小鼠免疫功能影響的實驗分組

1.5 檢測方法1次/d灌胃小鼠，10 d后通過對小鼠的臟器/體重比值、吞噬功能和T淋巴細胞增殖及細胞因子的測定，檢測牛肝菌醇提取物對小鼠免疫功能的影響。

1.5.1臟器/體重比值測定 小鼠頸椎脫臼處死稱重后，立即取出胸腺和脾臟，用濾紙吸干血液后稱重，胸腺（脾）指數(shù)單位：胸腺（脾）質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量（mg/10 g）。

1.5.2吞噬功能 處死動物前3 d，以5%的淀粉肉湯啟動小鼠巨噬細胞，采用半體內(nèi)法檢測腹腔巨噬細胞吞噬功能，以100個巨噬細胞中吞噬酵母菌的巨噬細胞數(shù)（吞噬率）及每個巨噬細胞吞噬酵母菌的個數(shù)（吞噬指數(shù)）作為評價指標。

1.5.3MTT法測定T淋巴細胞增殖 無菌取出脾臟，制成脾細胞懸液，用RPMI-1640不完全營養(yǎng)液洗滌3次，1 000 rpm離心10 min，然后用完全營養(yǎng)液配成1×107/mL。取100μL加入96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1×106個細胞，每個樣品做3個復孔。再加入240 mg/L的PHA 20μL，使終濃度為40 mg/L，同時設不加PHA的對照孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10μL MTT溶液（5 g/L），再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，棄上清液，然后加入30%DMSO 100μL，充分振蕩后靜置20 min，用酶標儀于波長570 nm處測A值。

1.5.4細胞因子的檢測 將動物用乙醚麻醉以后，摘眼球取血，將血液靜置離心后，獲得血清，用ELISA法測IL-2及TNFα，具體按試劑盒說明操作步驟進行。

1.6 統(tǒng)計學分析應用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。顯著性檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同處理小鼠臟器/體重指數(shù)比較

2.1.1胸腺指數(shù) 胸腺指數(shù)是衡量機體免疫功能的指標之一。由表1可知，從總體上看，不同處理組中小鼠的胸腺指數(shù)均高于陰性對照組。其中，脂溶組的胸腺指數(shù)最高，其次為水溶組，最后為牛肝菌和環(huán)磷酰胺組。除水溶組外，其他處理組中雌性小鼠的胸腺指數(shù)均高于雄性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。牛肝菌水溶組中：雄性組的胸腺指數(shù)高于對應的溶劑對照組（P＜0.05），而雌性組則無此變化。

2.1.2脾指數(shù) 不同處理組小鼠的脾指數(shù)見表1。由表1可知，脂溶組小鼠的脾指數(shù)高于水溶組；環(huán)磷酰胺脂溶組小鼠的脾指數(shù)高于脂溶組和水溶組（P＜0.05）；不同處理組中雌性小鼠的脾指數(shù)均高于雄性，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 不同處理小鼠吞噬功能比較通過比較不同處理后小鼠吞噬率和吞噬指數(shù)發(fā)現(xiàn)，不同處理組之間小鼠的吞噬率和吞噬指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 不同處理小鼠T淋巴細胞增殖比較對不同處理組小鼠的T淋巴細胞增殖進行比較發(fā)現(xiàn)：脂溶組小鼠的T淋巴細胞增殖強于水溶組；環(huán)磷酰胺脂溶組小鼠的T淋巴細胞增殖強于環(huán)磷酰胺水溶組（P＜0.05）；不同處理對雌性和雄性小鼠的T淋巴細胞增殖影響不大。

2.4 不同處理小鼠細胞因子比較

2.4.1細胞因子IL-2 除環(huán)磷酰胺雌性組與其余各組中細胞因子IL-2差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4.2細胞因子TNFα 對于細胞因子TNFα，不同處理組之間差異較大，見表1。

3 討論

目前報道的牛肝菌營養(yǎng)成分中，野生牛肝菌中硒的含量非常豐富〔6〕，而硒具有抗氧化及增強機體免疫力的作用；美味牛肝菌的油脂成分具有增強機體免疫能力、抗腫瘤的作用〔7〕。

本研究通過不同處理后，測定小鼠的臟器/體重比值、吞噬功能和T淋巴細胞增殖及細胞因子，結(jié)果顯示：脂溶組中小鼠的大多數(shù)指標均高于水溶組，提示牛肝菌水溶劑對正常小鼠的免疫增強作用弱于脂溶劑；并且牛肝菌對雌性小鼠的免疫增強作用強于雄性小鼠，其機理有待于進一步研究。與劉佳等人研究結(jié)果相比較〔6〕，本研究實驗組NGJ+CTX水溶組，NGJ+CTX脂溶組的胸腺指數(shù)均較其牛肝菌9 g/（kg·bw）+CTX50 mg/（kg·bw）組胸腺指數(shù)高，提示本實驗方案的劑量組合效率較高。

表1 牛肝菌對小鼠免疫功能的影響（

表1 牛肝菌對小鼠免疫功能的影響（

注：A：P＜0.05，vs NGJ水溶 雌性；B：P＜0.05，vs NGJ水溶 雄性；C：P＜0.05，vs NGJ酯溶 雌性；D：P＜0.05，vs NGJ酯溶 雄性；E：P＜0.05，vs NGJ+CTX水溶 雌性；F：P＜0.05，vs NGJ+CTX水溶 雄性；G：P＜0.05，vs NGJ+CTX酯溶 雌性；H：P＜0.05，vs NGJ+ CTX酯溶 雄性；I：P＜0.05 vs其余各組；J：P＜0.05 vs NGJ水溶 雄性，NGJ酯溶 雌性，NGJ酯溶 雄性，NGJ+CTX水溶 雌性；K：P＜0.05 vs NGJ+CTX酯溶 雌性，DMSO，ddH2O，CTX；L：P＜0.05 vs NGJ+CTX酯溶雌性，DMSO，ddH2O，CTX；M：P＜0.05 vs ddH2O；N：P＜0.05 vs ddH2O，CTX雄性。

分組 胸腺指數(shù) 脾指數(shù) 淋巴細胞增殖 吞噬率 吞噬指數(shù) IL-2 TNFα A 25.40±3.88 32.05±4.56 0.74±0.28 0.015±0.02 1.17±0.00 7.65±11.15 23.19±5.32jB 25.63±4.86 28.45±3.95 0.65±0.22 0.39±0.11 2.08±0.83 6.51±4.66 153.31±156.67kC 38.90±16.34a 35.41±11.00 0.83±0.11 0.23±0.18 1.81±0.29 4.09±1.26 168.88±102.97lD 20.77±14.18c 29.72±4.71 0.92±0.43b 0.28±0.00 1.39±0.00 5.43±4.66 136.86±274.87mE 25.72±8.81 27.16±5.45 0.74±0.17 0.27±0.16 1.65±0.48 5.67±0.76 28.31±3.48nF 19.98±18.68 16.39±5.90 0.49±0.26e 0.23±0.03 1.70±0.34 5.90±0.78 42.42±35.11 G 29.72±12.08 53.84±18.85c,e 1.15±0.57e 0.26±0.06 1.77±0.62 5.42±0.99 26.11±4.28 H 20.55±5.93 47.85±18.93d,f,g 1.15±0.53f 0.32±0.20 1.93±0.45 6.48±1.01 21.47±1.44 I 38.59±13.94 37.30±13.22 0.74±0.19 0.37±0.28 2.37±0.86 4.34±1.46 21.47±1.44 J 18.52±8.36 28.72±6.17 0.82±0.16 0.36±0.17 2.06±0.73 5.09±4.38 28.97±20.24 K 25.31±3.77 27.69±7.56 0.61±0.13 0.26±0.06 1.70±0.24 5.04±2.87 17.09±4.81 L 9.71±2.69b 26.07±4.51 0.66±0.25 0.27±0.81 1.71±0.31 3.82±1.44 18.93±7.18 M 32.82±10.37 44.87±24.48e 0.57±0.21g 0.28±0.15 1.95±0.60 6.15±1.19i 30.24±9.37 N 12.96±6.09 38.75±15.50f 0.59±0.16h 0.25±0.19 2.29±0.83 12.34±6.96 26.82±6.83

TNF各組之間存在不同程度的差異，主要集中于NGJ水溶組及酯溶組與其余各組之間；提示牛肝菌的水溶提取物及酯溶提取物均有較高的抗腫瘤作用。

綜上所述，根據(jù)免疫功能檢驗方法〔8〕的判定標準（臟器/體重比值測定和淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化試驗陽性），說明牛肝菌有增強免疫功能的作用及抗腫瘤作用。但牛肝菌水溶液的免疫增強作用弱于脂溶液和雌性小鼠的免疫增強作用強于雄性小鼠的機理、牛肝菌具體的功效成分、作用強度、以及劑效關系等有待于進一步研究。

〔1〕周玲仙，殷建忠.云南野生食用牛肝菌營養(yǎng)成分分析及評價〔J〕.食用菌，2008，30（4）：61-62.

〔2〕李娟，李平，卜可華.幾種牛肝菌抗氧化能力的研究〔J〕.中國食品添加劑，2007（1）：49-53.

〔3〕Kasuga A，Aoyagi Y，Sugahara T.Antioxidant activity of fungus Suillus bovinus（L：Fr）O.Kuntze〔J〕.Journal of Food Science，1995（60）：1113-1115.

〔4〕王一心，楊桂芝，狄勇.華美牛肝菌對高脂血癥大鼠血脂及抗氧化作用的影響〔J〕.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2004（4）：479-480.

〔5〕唐薇，魯新成.美味牛肝菌多糖的生物活性及其抗S-180腫瘤的效應〔J〕.西南師范大學學報，1999，24（4）：478-481.

〔6〕劉佳，高敏，殷忠，等.野生牛肝菌營養(yǎng)成分分析及對小鼠免疫功能的影響〔J〕.微量元素與健康研究，2007，1（1）：5-7.

〔7〕李志洲.美味牛肝菌中油脂成分的提取及其成分分析〔J〕.氨基酸和生物資源，2009，31（2）：17-20.

〔8〕闞國仕，矯麗曼，楊玉紅，等.牛肝菌胞外多糖體外抗氧化能力的研究〔J〕.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（2）：57-60.

*通信作者：申元英，教授.

（責任編輯 毛本勇）

Effect of Bolete on Mice Immune Function

WANG Tao,LI Lijuan，SHEN Yuanying*
（Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To observe the effect of bolete on immune function of mice.Methods:Intragastric administration of bolete in aqueous solution or in lipid solution into the mice for 10 days consecutively.Organ weight of thymus and spleen,phagocytic capacity of macrophage,proliferation of T lymphocyte and cytokines inducement were investigated.Results:Indexes of lipid solution group were higher compared with that of aqueous group.Bolete manifested obvious effect on immunologic enhancement of female mice compared with the male mice.Conclusion:Bolete could enhance immune function and show anti-tumor effect in mice.

bolete;immunity;mice

R34

A

1672-2345（2012）06-0020-03

云南省中青年學術技術帶頭人后備人才培養(yǎng)基金資助項目（2006PY057）

2012-01-10

2012-04-14

王濤，實驗師，主要從事預防醫(yī)學研究.