腈水解酶重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及應(yīng)用

吳 喬，薛亞平，鄭裕國

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江 杭州 310014)

腈水解酶是一類能選擇性催化腈化合物生成酸和氨的蛋白酶[1，2]，具有來源廣泛、反應(yīng)條件溫和、高效專一等特點(diǎn)，常用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[3，4]。

R-(-)-扁桃酸是一種重要的手性中間體，具有很好的生物分解性，是目前最受矚目的酸性光學(xué)拆分劑，廣泛應(yīng)用于多種光學(xué)活性醫(yī)藥、農(nóng)藥的合成和手性化合物的光學(xué)拆分[3]。此外，R-(-)-扁桃酸的新的用途正不斷被發(fā)掘，市場需求日益增大[5]，其制備越來越受到重視。

R-(-)-扁桃酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和生物法，其中生物法中的腈水解酶催化法由于底物價廉、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)物光學(xué)純度高，具有良好的工業(yè)化前景[1，5]。目前已報道的腈水解酶菌株主要有AlcaligenesfaecalisATCC 8750[6，7]、PseudomonasputidaMTCC 5110[8，9]、Alcaligenessp.ECU0401[10，11]等。構(gòu)建腈水解酶基因工程菌并進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶已成為工業(yè)化生產(chǎn)R-(-)-扁桃酸的重要手段。Banerjee等[12]對P.putidaMTCC 5110的腈水解酶基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建了重組菌E.colipET21b(+)-PspNit，但其搖瓶發(fā)酵的生物量較低，單位體積產(chǎn)酶不高。張志鈞等利用來自Alcaligenessp.ECU0401的腈水解酶基因重組得到E.coliJM109，優(yōu)化后，搖瓶生物量為3.13 gdcw·L-1，產(chǎn)酶量達(dá)到4760 U·L-1，e.e.值大于95%[13，14]。

Xue等[15，16]通過大規(guī)模的篩選和育種，獲得一株高活性的立體選擇性腈水解酶菌株A.faecalisZJUTB10，并利用該腈水解酶進(jìn)行了生物催化外消旋扁桃腈生產(chǎn)R-(-)-扁桃酸的研究。用PCR方法擴(kuò)增出A.faecalisZJUTB10腈水解酶基因，并將其插入到表達(dá)載體pET28b(+)中，IPTG誘導(dǎo)后，腈水解酶在大腸桿菌胞內(nèi)進(jìn)行了活性表達(dá)，具有較高的活性[17]。

作者在此優(yōu)化了含有A.faecalisZJUTB10腈水解酶基因的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-NIT的培養(yǎng)基組分以及誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件，擬為生物法工業(yè)化催化扁桃腈生產(chǎn)R-(-)-扁桃酸提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

產(chǎn)腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-NIT，目的基因源于A.faecalisZJUTB10，該基因序列全長1068 bp，編碼372個氨基酸，預(yù)測其分子量為41 548 Da，該序列已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫登記號為HQ407378，自行構(gòu)建。

扁桃腈(Acros)、扁桃酸(J&K)，其余試劑均為市售分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

高速離心機(jī)，美國Beckman Coulter；FA2004型電子分析天平，上海精密儀器儀表有限公司；SPD-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司；Sky-110WX型水浴搖床，上海蘇坤有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出汁5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，卡那霉素50 mg·L-1，121 ℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出汁5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH值7.5，121 ℃滅菌20 min。

1.3 方法

初始培養(yǎng)方法：從甘油管或斜面挑取重組工程菌至裝液量為50 mL (250 mL三角瓶)的種子培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，取1 mL種子液于裝液量為100 mL(500 mL三角瓶)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)4 h后加誘導(dǎo)劑乳糖2.0 g·L-1，轉(zhuǎn)入28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h后離心收集菌體。

轉(zhuǎn)化方法：將菌體用生理鹽水(0.85%)洗滌，稱取0.05 g菌體懸浮于10 mL(pH值8.5)Tris-HCl緩沖溶液中(測產(chǎn)酶時取1 mL發(fā)酵液離心，收集菌體，生理鹽水洗滌后懸浮于5 mL緩沖溶液中)，加入底物R，S-扁桃腈(終濃度50 mmol·L-1)，35 ℃、180 r·min-1下反應(yīng)20 min，立即取樣1 mL，12 000 r·min-1離心6 min終止反應(yīng)，取上清液，檢測產(chǎn)物和底物的濃度。

1.4 分析檢測

1.4.1 生物量的測定

取30 mL發(fā)酵液離心收集菌體，并用生理鹽水(0.85%)洗滌，90 ℃烘干至恒重，即為發(fā)酵液的生物量，以gdcw·L-1計。

1.4.2 酶活的測定

產(chǎn)物和底物濃度的檢測：色譜柱為Hypersil ODS(250 mm×4.6 mm，填料粒徑5 μm)，流動相為甲醇∶NH4H2PO4(50 mmol·L-1)=35∶65 (體積比)，柱溫 35 ℃，流速1 mL·min-1，檢測波長228 nm。

酶活力定義為：每分鐘催化生成1 μmolR-(-)-扁桃酸所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.4.3 產(chǎn)物對映體過量值的測定

將轉(zhuǎn)化樣品用濃鹽酸調(diào)pH值至1.5，加入等體積乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)相，風(fēng)干，干燥后將白色晶體溶解于流動相正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸(90∶10∶0.1)，用于色譜分析。色譜柱為CHIRALEL-OD-H手性柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm；Daicel Chemical Industries，Japan)，柱溫40 ℃，流速0.8 mL·min-1，檢測波長228 nm。R-(-)-扁桃酸的光學(xué)純度通過計算對映體過量值(e.e.值)來評價。

式中：cR和cS分別為R型和S型異構(gòu)體的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對重組菌產(chǎn)酶的影響

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，考察不同碳源對菌株生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見表1。

表1 碳源對菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由表1可知，碳源為甘油、葡萄糖、麥芽糖和甘露醇時，在乳糖誘導(dǎo)下，酶活很低或者沒有；碳源為玉米漿粉時比酶活和產(chǎn)酶量最高，分別達(dá)到約209.19 U·g-1、2275.99 U·g-1，生物量較高，約為2.72 gdcw·L-1。綜合考慮，選擇最佳碳源為玉米漿粉。

玉米漿粉濃度對菌株生長和產(chǎn)酶的影響見圖1。

圖1 玉米漿粉濃度對菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由圖1可知，玉米漿濃度為10 g·L-1時比酶活最高，但生物量不高；玉米漿粉濃度為25 g·L-1時，產(chǎn)酶量最高，達(dá)2505.39 U·L-1；考慮到產(chǎn)酶，選擇最佳玉米漿粉濃度為25 g·L-1。

2.2 氮源對重組菌產(chǎn)酶的影響

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，考察不同氮源對菌株生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見表2。

表2 氮源對菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由表2可知，氮源為酵母浸出汁時，比酶活有明顯優(yōu)勢，產(chǎn)酶量也最高。因此，選擇最佳氮源為酵母浸出汁。

酵母浸出汁濃度對菌株生長和產(chǎn)酶的影響見圖2。

圖2 酵母浸出汁濃度對菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，選擇最佳酵母浸出汁濃度為5 g·L-1，比酶活和產(chǎn)酶量均最高，分別為210.29 U·g-1和2458.76 U·L-1。

2.3 磷酸鹽對重組菌產(chǎn)酶的影響

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，考察不同磷酸鹽對菌株生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖3。

1.K2HPO4 2.KH2PO4 3.Na2HPO4 4.NaH2PO4 5.(NH4)2HPO4 6.NH4H2PO4 7.Control

由圖3可知，KH2PO4、NaH2PO4、NH4H2PO43種磷酸鹽對比酶活有促進(jìn)作用，分別為262.67 U·g-1、245.27 U·g-1、244.60 U·g-1(對照樣比酶活為234.15 U·g-1)，說明含2個氫離子的磷酸鹽利于腈水解酶的表達(dá)，但是磷酸鹽的加入減少了生物量，抑制了產(chǎn)酶。

至此，我終于明白了。她所謂的“怕”，其實(shí)是面對弱者的遭遇無力提供幫助而產(chǎn)生的自責(zé)，繼而形成的逃避行為。

2.4 金屬離子對重組菌產(chǎn)酶的影響(表3)

表3 金屬離子對菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由表3可知，Cu+、Mg2+(MgCl2·6H2O)、Fe3+、Fe2+、Al3+、Ca2+對相對酶活有促進(jìn)作用，對生物量影響不一，F(xiàn)e3+、Fe2+有利于菌株產(chǎn)酶(分別提高3.71%和2.45%)，由于Fe2+在空氣中容易被氧化成Fe3+，可認(rèn)為Fe3+促進(jìn)了菌株產(chǎn)酶。

Fe3+濃度對菌株生長和產(chǎn)酶的影響見圖4。

圖4 Fe3+濃度對菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由圖4可知，選擇最佳Fe3+濃度為0.5 mmol·L-1，比酶活和產(chǎn)酶量最高，分別為252.49 U·g-1和2502.89 U·L-1。

2.5 誘導(dǎo)劑乳糖濃度對重組菌產(chǎn)酶的影響(圖5)

圖5 乳糖濃度對菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，隨著乳糖濃度的增大，菌株生物量上升，比酶活和產(chǎn)酶量呈現(xiàn)先升后降的趨勢。選擇最佳乳糖濃度為0.5 g·L-1，比酶活和產(chǎn)酶量最高，分別為340.91 U·g-1和3262.84 U·L-1。

2.6 誘導(dǎo)溫度對重組菌產(chǎn)酶的影響(圖6)

圖6 誘導(dǎo)溫度對菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由圖6可知，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，比酶活和產(chǎn)酶量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在30 ℃時最高，分別為352.06 U·g-1和3791.12 U·L-1；菌株生物量呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢，在30 ℃時最高，而后下降，超過35 ℃時，又緩慢回升。綜合考慮，選擇最佳誘導(dǎo)溫度為30 ℃。

2.7 乳糖加入時間對產(chǎn)酶的影響(圖7)

圖7 乳糖加入時間對菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由圖7可知，隨著乳糖加入時間的延后，比酶活和產(chǎn)酶呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在乳糖加入時間為6 h時最高，分別為368.04 U·g-1和3880.50 U·L-1；菌株生物量呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢。綜合考慮，選擇最佳乳糖加入時間為6 h。

2.8 重組菌產(chǎn)酶過程(圖8)

自誘導(dǎo)劑加入后開始計時，不同時間取樣分析檢測誘導(dǎo)過程中pH值、比酶活、生物量以及產(chǎn)酶量的變化，見圖8。

圖8 加入乳糖后發(fā)酵過程中菌株生長和產(chǎn)酶的變化

由圖8可知，隨著誘導(dǎo)時間的延長，pH值沒有明顯變化，生物量一直呈上升趨勢，比酶活在16 h時達(dá)到最高368.92 U·g-1，其后急劇下降。從產(chǎn)酶出發(fā)考慮，選擇最佳誘導(dǎo)時間為28 h，其生物量、比酶活以及產(chǎn)酶量分別為5.27 gdcw·L-1、297.15 U·g-1和6161.46 U·L-1。

2.9 重組菌腈水解酶不對稱催化轉(zhuǎn)化外消旋型扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸

以最優(yōu)培養(yǎng)條件下獲得的菌體催化外消旋型扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸，結(jié)果見圖9。

圖9 菌體催化扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸的過程

由圖9可知，初始底物濃度為47.77 mmol·L-1，轉(zhuǎn)化50 min后產(chǎn)物濃度為43.96 mmol·L-1，轉(zhuǎn)化率達(dá)92.02%，產(chǎn)物e.e.值達(dá)99%以上，表明該酶的立體選擇性很嚴(yán)格。

3 結(jié)論

對于重組菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b(+)-NIT產(chǎn)腈水解酶，最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：玉米漿粉25 g·L-1，酵母浸出汁5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，F(xiàn)e3+0.5 mmol·L-1，初始pH值7.5；最適誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件為：誘導(dǎo)劑乳糖0.5 g·L-1，誘導(dǎo)劑加入時間為接種6 h后，誘導(dǎo)溫度30 ℃，誘導(dǎo)時間28 h。在該條件下，產(chǎn)酶量達(dá)到6161.46 U·L-1，所得菌體用于不對稱轉(zhuǎn)化R，S-扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)92.02%，產(chǎn)物e.e.值達(dá)99%以上。該菌株十分有潛力作為R-(-)-扁桃酸工業(yè)生產(chǎn)的生物催化劑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 徐賽珍，鄭裕國.選擇性腈水解酶在生物催化中的應(yīng)用[J].浙江化工，2009，40(5)：13-18.

[2] Singh R，Sharma R，Tewari N，et al.Nitrilase and its application as a ′green′ catalyst[J].Chem Biodivers，2006，3(12)：1279-1287.

[3] 鄭裕國，薛亞平，沈寅初，等.腈轉(zhuǎn)化酶在精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報，2009，25(12)：1795-1807.

[4] 徐建妙，鄭裕國，沈寅初.腈水解酶的來源、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報，2005，32(5)：141-146.

[5] 陳艷，薛亞平，鄭裕國.生物催化法合成R-扁桃酸的研究進(jìn)展[J].精細(xì)與專用化學(xué)品，2010，18(2)：55-60.

[6] Yamamoto K，F(xiàn)ujimatsu I，Komatsu K I.Purification and characterization of the nitrilase fromAlcaligenesfaecalisATCC 8750 responsible for enantioselective hydrolysis of mandelonitrile[J].J Ferment Bioeng，1992，73(6)：425-430.

[7] Yamamoto K，Kazuhiko O，Isao F，et al.Production ofR-(-)-mandelic acid from mandelonitrile byAlcaligenesfaecalisATCC 8750[J].Appl Environ Microbiol，1997，57(10)：3028-3032.

[8] Kaul P，Banerjee A，Mayilraj S，et al.Screening for enantioselective nitrilases：Kinetic resolution of racemic mandelonitrile to (R)-(-)-mandelic acid by new bacterial isolates[J].Tetrahedron：Asymmetry，2004，15(2)：207-211.

[9] Naik S C，Kaul P，Banerjee A，et al.Studies on the production of enantioselective nitrilase in a stirred tank bioreactor byPseudomonasputidaMTCC 5110[J].Bioresource Technology，2008，99(1)：26-31.

[10] He Y C，Xu J H，Xu Y，et al.Biocatalytic synthesis of (R)-(-)-mandelic acid from racemic mandelonitrile by a newly isolated nitrilase-producerAlcaligenessp.ECU0401[J].Chinese Chemical Letters，2007，18(6)：677-680.

[11] Zhang Z J，Xu J H，He Y C，et al.Cloning and biochemical properties of a highly thermostable and enantioselective nitrilase fromAlcaligenessp. ECU0401 and its potential for (R)-(-)-mandelic acid production[J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2011：34(3):315-322.

[12] Banerjee A，Dubey S，Kaul P，et al.Enantioselective nitrilase fr-omPseudomonasputida：Cloning，heterologous expression，and bioreactor studies[J].Mol Biotechnol，2009，41(1)：35-41.

[13] Liu J F，Liu Z J，Xu J H，et al.Significantly enhanced production of recombinant nitrilase by optimization of culture conditions and glycerol feeding[J].Appl Microbiol Biotechnol，2010，89(3):665-672.

[14] Zhang Z J，Xu J H，He Y C，et al.Efficient production of (R)-(-)-mandelic acid with highly substrate/product tolerant and enantioselective nitrilase of recombinantAlcaligenessp.process[J].Biochemistry，2010，45(6)：887-891.

[15] Xue Y P，Xu S Z，Liu Z Q，et al.Enantioselective biocatalytic hydrolysis of (R，S)-mandelonitrile for production of (R)-(-)-mandelic acid by a newly isolated mutant strain[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2011，38(2)：337-345.

[16] Xue Y P，Liu Z Q，Xu M，et al.Enhanced biotransformation of (R，S)-mandelonitrile to (R)-(-)-mandelic acid with in situ production removal by addition of resin[J].Biochem Eng J，2011，53(1)：143-149.

[17] Liu Z Q，Dong L Z，Cheng F，et al.Gene cloning，expression，and characterization of a nitrilase fromAlcaligenesfaecalisZJUTB10[J].J Agr Food Chem，2011，59(21)：11560-11570.