低氧對間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

尚萍 李小林

隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及高分子材料學(xué)的快速發(fā)展，使干細(xì)胞技術(shù)運用于臨床成為可能，再生醫(yī)學(xué)的研究內(nèi)容就是如何將干細(xì)胞發(fā)育成組織并應(yīng)用這種潛能進行組織替代療法，從而恢復(fù)受損組織的正常結(jié)構(gòu)和功能[1]。再生醫(yī)學(xué)的研究，都是圍繞干細(xì)胞而展開的，其中間充質(zhì)干細(xì)胞由于其分離培養(yǎng)簡便，具有自我更新能力和多分化潛能等優(yōu)點，受到了最多的關(guān)注。早在1966年，F(xiàn)riedenstein[2]首次描述了使用骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在組織中進行培養(yǎng)。之后Caplan[3]發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞在各間質(zhì)譜系中具有分化潛能，并將這類細(xì)胞命名為間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為血液、骨、軟骨、脂肪、肌肉、表皮、上皮、神經(jīng)等組織的潛能，在組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用，同時也是再生醫(yī)學(xué)研究中最重要的種子細(xì)胞[4]。在干細(xì)胞研究中，細(xì)胞體外培養(yǎng)是必不可少的步驟，其中細(xì)胞微環(huán)境是影響其生物學(xué)行為的重要因素，培養(yǎng)所需的最適氧張力被認(rèn)為是微環(huán)境的重要組成部分。生理氧張力在不同的組織中各不相同，在血液中約為12%，而在深部的軟骨組織低至1%[5]，在骨髓中氧的張力被認(rèn)為在4%～7%[6]之間或者低至1%～2%[7-8]。目前均認(rèn)為，細(xì)胞在體內(nèi)的氧張力低于大氣中的氧張力（21%）。早在1958年，Cooper等[9]發(fā)現(xiàn)在低于常氧的條件下培養(yǎng)細(xì)胞時，某些細(xì)胞的增殖能力更強。此外機體也常會有病理性低氧狀態(tài)，如心臟驟停后由于缺氧造成組織缺血問題。近些年低氧在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究倍受關(guān)注[10-12]。本文結(jié)合相關(guān)文獻全面綜述了低氧對間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)分子機制，試圖摸索細(xì)胞最適培養(yǎng)環(huán)境。通過控制細(xì)胞培養(yǎng)的氧濃度為更好地培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，并使其在再生醫(yī)學(xué)的運用中達到預(yù)期的成果提供依據(jù)。

1低氧對間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響

將細(xì)胞植入到缺血部位后，細(xì)胞在長期修復(fù)應(yīng)答反應(yīng)中的存活能力對再生醫(yī)學(xué)來說非常重要。Geng等[13]將MSCs注入到心肌梗塞的小鼠心室，4天后檢測到99%的MSCs死亡。也有文獻報道MSCs運用于椎間疾病[14-15]或軟骨修復(fù)[16]中的遠(yuǎn)期死亡較少。在缺氧環(huán)境中，細(xì)胞并不依賴三磷酸腺苷（ATP）氧化磷酸化所提供能量，因為這條通路在氧的環(huán)境進行。而糖酵解作用并不需要氧的參與，因此該通路為缺氧下的細(xì)胞提供能量。Zhu等[17]的研究中將MSC置于3%的低氧及無血清條件下（模擬缺血環(huán)境）培養(yǎng)，細(xì)胞中半胱天冬蛋白酶-3（caspase-3）活性增高，發(fā)生依賴caspase的凋亡，但是單獨的低氧條件并不能增高caspase-3的活性，誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)不明顯。該研究結(jié)果表明，MSC對低氧缺血的環(huán)境敏感，但導(dǎo)致其凋亡的主要因素不為低氧。細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄因子的作用對氧起反應(yīng)，最重要的影響因子是低氧誘導(dǎo)因子－1α（hypoxic inducible foctor-1,HIF-1α）。HIF-1α在常氧下被降解，在低氧條件下穩(wěn)定表達[18]。Greijer等[19]的實驗表明，低氧的嚴(yán)重程度決定著細(xì)胞凋亡，0.5%的氧可以啟動細(xì)胞的凋亡，在此過程中涉及HIF-1誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）的表達升高，若抑制VEGF的表達，細(xì)胞凋亡數(shù)增加。

盡管間充質(zhì)干細(xì)胞能在缺血的組織中存活幾天，但我們需要的是長期存活能力。在低氧下預(yù)培養(yǎng)MSCs能增強細(xì)胞移植到體內(nèi)后的存活率[20]。這些都是經(jīng)過一系列復(fù)雜的信號通路后所產(chǎn)生的減少細(xì)胞凋亡的有利結(jié)果。由于低氧可增強Akt基因蛋白表達，孔宏亮等[21]將轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染Akt基因的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞置于1%的氧濃度培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Akt基因的間充質(zhì)干細(xì)胞能減少低氧時的凋亡和提高缺氧時的增殖能力。

2低氧對間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

生理健康組織的氧體積分?jǐn)?shù)大多都低于常氧，骨髓也處于低于常氧的環(huán)境中，而間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源于骨髓。相關(guān)研究表明，在生理氧張力范圍下培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞能促進其增殖。Lennon等[6]在低于5%的氧中培養(yǎng)小鼠的MSCs，發(fā)現(xiàn)其增殖率相對常氧下培養(yǎng)大約多出40%。Grayson等[22-23]的實驗也得到相同的結(jié)論，他們將氧體積分?jǐn)?shù)降至2%時，在三維支架中培養(yǎng)出的細(xì)胞比常氧下培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且他們發(fā)現(xiàn)在三維支架中培養(yǎng)的細(xì)胞初期時顯示出一個長時間的延遲期，但在培養(yǎng)23天后其增殖率仍比常氧下高出許多倍。Grayson等認(rèn)為在低氧下培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞并不能使其短時間內(nèi)迅速增殖，而是使細(xì)胞增殖的持續(xù)時間被延長了，表明低氧是在培養(yǎng)后期（G2/S/M）維持其增殖速率。對于間充質(zhì)干細(xì)胞在低于常氧下培養(yǎng)是在短期內(nèi)還是在培養(yǎng)后期提高其增殖率，研究者的結(jié)果各不相同。Rosova等[24]將細(xì)胞置于1%氧中培養(yǎng)16h，沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在短期內(nèi)迅速增殖；Hung等[25]將人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用17%的牛血清培養(yǎng)液，并放在1%的氧中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的短期增殖率較低。以上的研究結(jié)果與Grayson等相符。相反的，Martin-Rendon等[26]將細(xì)胞置于1.5%的氧中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在短期內(nèi)迅速促進細(xì)胞周期的進行，提高細(xì)胞的增殖。

總之，在生理范圍內(nèi)的低氧下無論是單獨培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞還是在三維支架中培養(yǎng)，都能促進其增殖效率。不論通過擴增其增殖能力還是降低其倍增的時間都與氧的濃度及細(xì)胞的類型和其他的培養(yǎng)條件相關(guān)。低氧下改變細(xì)胞增殖的內(nèi)在機制目前仍不明確，Yun等[27]認(rèn)為是雌二醇-17β的作用。在低氧下，Oct-4和Rex-1的表達水平都更高，提示低氧能維持早期間充質(zhì)干細(xì)胞表型，在低氧下也可能是通過上調(diào)HIF-1α或HIF-2α的活性來促進間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[28]。

3低氧對間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響

成人體內(nèi)軟骨祖細(xì)胞自我再生能力較弱，MSCs分化為軟骨對軟骨的再生有重大意義。體內(nèi)軟骨所處的氧環(huán)境低于常氧，MSCs在形成軟骨的過程中，氧濃度對其代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前，關(guān)于低氧對間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨、成骨分化的作用結(jié)果并不一致。有些學(xué)者認(rèn)為低氧對MSCs成軟骨、成骨分化作用無明顯影響，Scherer等[29]將MSCs置于5%的氧培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)低氧并沒有抑制細(xì)胞向軟骨分化，但細(xì)胞成軟骨分化能力也未見明顯增強。Salim等[30]將細(xì)胞置于2%的氧與常氧下培養(yǎng)時，細(xì)胞向成骨分化的能力未見明顯差異，但是當(dāng)氧體積分?jǐn)?shù)為0.02%時，細(xì)胞向成骨分化的能力減弱；另一些學(xué)者認(rèn)為低氧能促進MSCs向軟骨、成骨分化，Wang等[31]將MSCs分別置于體積分?jǐn)?shù)為5%的氧與常氧下培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)在低氧條件下細(xì)胞分泌大量與軟骨相關(guān)的基質(zhì)分子，其中膠原合成率較常氧下明顯增加，促進軟骨分化。Lennon等[6]將細(xì)胞置于5%的氧與常氧下培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)一直在低氧下培養(yǎng)的細(xì)胞向成骨分化的能力比在常氧下培養(yǎng)強。D＇Ippolito等[28]的研究得出完全不同的結(jié)論，他們認(rèn)為在低氧下或經(jīng)低氧預(yù)處理后的細(xì)胞向成骨分化的能力比常氧下降低。Potier等[32]則認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響因素不僅與不同程度的低氧有關(guān)，還可能與暴露于低氧環(huán)境的時間長短有關(guān)。

干細(xì)胞向軟骨、成骨分化的信號通路仍不是很明確，在少有的相關(guān)報道中，Kanichai等[33]的研究試圖說明細(xì)胞分化為軟骨的相關(guān)機制，他們認(rèn)為軟骨分化受一系列轉(zhuǎn)錄因子操縱，其中Sox家族的作用最為明顯，可能是因為低氧激活HIF-1，進而活化Sox-9，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨相關(guān)基質(zhì)分泌增多，從而促進細(xì)胞成軟骨化。

4低氧對間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和歸巢的影響

間充質(zhì)干細(xì)胞具有定向遷移能力，在骨折時可被損傷部位吸收并成功修復(fù)特定缺陷[16]；心肌梗死后由靜脈注射可定向遷移、歸巢于缺血的心肌[34]；在腦卒中，MSCs由血管可定向遷移到神經(jīng)組織并分化為神經(jīng)元細(xì)胞[35]。探究間充質(zhì)干細(xì)胞移植后向特異部位遷移的分子機制對間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用有極大的促進作用。目前認(rèn)為這種遷移過程可能與各種炎癥趨化因子、細(xì)胞因子及多種配體和受體的相互作用有關(guān)，如炎癥趨化因子中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）與其受體CXCR4[36]，CXCR4是祖細(xì)胞向缺血組織歸巢所需的重要趨化因子[37]。SDF-1與其受體CXCR4在干細(xì)胞表面的相互作用對移植后干細(xì)胞的遷移和歸巢都有重要的意義。

有研究顯示，SDF-1不僅介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞趨化，還促進其整合入局部缺血的損傷區(qū)[38]，SDF-1在缺血組織中選擇性的表達與氧體積分?jǐn)?shù)的減少成正比。在大鼠腦卒模型[37]，造模后第1，7天注射間充質(zhì)干細(xì)胞有利于腦功能恢復(fù)，且缺血腦組織中SDF-1在10天內(nèi)呈現(xiàn)較高水平。阻斷缺血組織的SDF-1或CXCR4的表達，間充質(zhì)干細(xì)胞則不能向損傷組織遷移。王心蕊等[39]通過Boyden小室，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：5%氧狀態(tài)下人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移速度明顯增快，且遷移到人工基底膜下的細(xì)胞也明顯多于常氧組。認(rèn)為可能是由于低氧環(huán)境中HIF-1活化上調(diào)SDF-1的基因表達，從而促進CXCR4陽性的干細(xì)胞粘附、遷移和歸巢到低氧部位。由于組織再生取決于間充質(zhì)干細(xì)胞向周圍血管的趨化性及隨后的分化，SDF-1可能起到促進血管和心肌再生的作用[40]。SDF-1與CXCR4兩種分子的表達對促進MSCs在再生醫(yī)學(xué)中的療效有重要意義。

綜上所述，低氧促進間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和歸巢，有利于其向缺血及受損部位遷移，發(fā)揮組織及血管修復(fù)作用。

5結(jié)語

干細(xì)胞移植在再生醫(yī)學(xué)中的運用是目前研究的熱點，低氧是一種重要的生理和病理現(xiàn)象。與其他類型細(xì)胞一樣，低氧對MSCs的生物學(xué)行為有一定影響，但與其他細(xì)胞不同的是，MSCs通過上調(diào)某些信號通路及增強糖酵解能力能使細(xì)胞在低氧環(huán)境中存活能力增強。在低氧下培養(yǎng)MSCs能促進其增殖，這對再生醫(yī)學(xué)的研究有非常重要的意義。另外，將MSCs在低氧下預(yù)處理后植入體內(nèi)，能提高間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活率，這對提高MSCs的治療效果有著非常重要的影響。在低氧下細(xì)胞的增殖率提高，細(xì)胞數(shù)量增加，MSCs在某些低氧條件下可分化為不同的細(xì)胞，其分化產(chǎn)物的類型依賴于各種條件：如特定的低氧張力，培養(yǎng)的時間及是否在低氧下預(yù)培養(yǎng)，MSCs的來源不同等因素。雖然目前低氧對MSC的研究結(jié)果有一定偏差，缺乏一致性，特別是低氧對其分化能力的影響，但可以明確的是氧張力對MSC的生物學(xué)作用及其在再生醫(yī)學(xué)中的運用是不可忽視的。通過控制氧張力來影響細(xì)胞的生物學(xué)行為在一系列的影響因素中最為突出，且簡單易行，但具體什么樣的氧體積分?jǐn)?shù)最有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與增殖、分化與歸巢以及其發(fā)生機制仍有待于進一步的研究。

[參考文獻]

[1]許怡薇,馮 凱,石炳毅.干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀及其前景[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(36):7163-7166.

[2]Friedenstein AJ,Piatetzky-Shapiro Ⅱ,Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells[J].J Embryol Exp Morphol,1966,16(3):381-390.

[3]Caplan AI.Mesenchymal stem cells[J].J Orthop Res,1991,9(4):641-650.

[4]Barry FP,Murphy JM.Mesenchymal stem cells:clinical applications and biological characterization[J].Int J Biochem Cell Biol, 2004,36(4):568-584.

[5]Csete M.Oxygen in the cultivation of stem cells[J].Ann N Y Acad Sci,2005,1049:1-8.

[6]Lennon DP,Edmison JM,Caplan AI.Cultivation of rat marrow-Derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension:effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis[J].J Cell Physiol,2001,187(3):345-355.

[7]Cipolleschi MG,Dello Sbarba P,Olivotto M.The role of hypoxia in the maintenance of hematopoietic stem cells[J].Blood,1993,82(7):2031-2037.

[8]Ma T,Grayson WL,Froblich M,et al.Hypoxia and stem cell-based engineering of mesenchymal tissues[J].Biotechnol Prog,2009,25(1):32-42.

[9]Cooper PD,Burt AM, Wilson JN.Critical effect of oxygen tension on rate of growth of animal cells in continuous suspended culture[J].Nature,1958,182(4648):15080-15089.

[10]Meijer GJ,de Brujin,JD,Koole R,et al.Cell based bone tissue engineering in jaw defects[J].Biomaterials,2008,29(21):3053-3061.

[11]Nesselmann C,Ma N,Bieback K,et al.Mesenchymal stem cells and cardiac repair[J].J Cell Mol Med,2008,12(58):1795-1810.

[12]Rouwkema J,Rivron NC,van Bitterswijk CA.Vascularization in tissue engineering[J].Trends Biotechnol,2008,26(75):434-449.

[13]Geng YJ.Molecular mechanisms for cardiovascular stem cell apoptosis and growth in the hearts with atherosclerotic coronary disease and ischemic heart failure[J].Ann NY Acad Sci,2003,1010:687-697.

[14]Sobajima S,Vadala G,Shimer A,et al.Feasibility of a stem cell therapy for intervertebral disc degeneration[J].Spine,2008,8(6),888-896.

[15]Zhang YG,Guo X,Xu P,et al.Bone mesenchymal stem cells transplanted into rabbit intervertebral idscs can increase proteoglyacns[J].Clin Orthop Relat Res,2005,(430):219-226.

[16]Murphy JM,Fink DJ,Hunziker EB,et al.Stem cell therapy in a caprine model of osteoarthritis[J].Arthritis Rheum,2003,48(12):3464-3474.

[17]Zhu W,Chen J,Cong X,et al. Hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2006,24(3):416-428.

[18]Jaakkola P,Mole DR,Tian YM,et al.Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation[J].Science,2001,292(76):468-493.

[19]Greijer AE,Vander wall E.The role of hypoxia inducible factor 1 in hypoxia induced apoptosis[J].J Clin Pathol,2004,57(10):1009-1014.

[20]Hu X,Yu Sp,Fraser JL,et al.Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2008,135(4),799-808.

[21]孔宏亮,張利群,齊國先,等.Akt基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧時凋亡和增殖的影響[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2008,17(3):225-231.

[22]Grayson WL,Zhao F,Bunnell B,et al.Hypoxia enchances prolife-ration and tissue formation of human mesenchymal stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,358(43):948-959.

[23]Grayson WL,Zhao F,Izadpanah R,et al.Effects of hypoxia on human mesenchymal stem cell expansion and plasticity in 3D constructs[J].J Cell Physiol,2006,207(59):331-352.

[24]Rosova I,Dao M,Capoccia B,et al.Hypoxic precond-Itioning results in increased motility and improved therapeutic potential of human mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2008,26(3):2173-2188.

[25]Hung SC,Pochampally RR,Hsu SC,et al.Short-term exposure of multipotent stromal cells to low oxygen increases their espression of CX3CR1 and CXCR4 and their engraftment in vivo[J].PLOS ONE,2007,2(3):416-426.

[26]Martin-Rendon E,Hale SJ,Ryan D,et al.Transcriptional profiling of human cord blood CD133+ and cultured bone marrow mesenchymal stem cells in response to hypoxia[J].Stem Cell,2007,25(5):1003-1017.

[27]Yun SP,Lee MY,Ryu JM,et al.Role of HIF-1 and VEGF in human mesenchymal stem cell proliferation by estradiol-17:Involvement of the PKC,PI13K/Akt,and MAPKs[J].Am J Physiol Cell Physiol,2008,296(56):317-326.

[28]D＇Ippolito G,Diabira S,Howard GA,et al.Low oxygen tension inhibits osteogenic differentiation and enhances stemness of human MIAMI cells[J].Bone,2006,39(27):513-526.

[29]Scherer K,Schunke M,Sellckau R,et al.The influence of oxygen and hydrostatic pressure on articular chondrocytes and adherent bone marrow cells in vitro[J].Biorheology,2004,41(19):323-333.

[30]Salim A,Nacamuli RP,Morgan EF,et al.Transient changes in oxygen tension inhibit osteogenic differentiation and Runx2 expression in osteoblasts[J].J Biol Chem,2004,279(38):4007-4025.

[31]Wang DW,Fermor B,Gimble JM,et al.Influence of oxygen on the proliferation and metabolism of adipose derived adult stem cells[J].J Cell Physiol,2005,204(1):184-196.

[32]Potier E,Ferreira E,Andriamanalijaona R,et al.Hypoxia affects mesenchymal stromal cell osteogenic differentiation and angiogenic factor expression[J].Bone,2007,40(4):1078-1086.

[33]Kanichai M,Ferguson D,Prenderqast PJ,et al.Hypoxia promotes chondrogenesis in rat messenchymal stem cells:a role for AKT and hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha[J].J Cell Physiol,2008,216(3):708-715.

[34]Barbash IM,Chouraqui P,Baron J,et al.Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium:feasibility,cell migration,and body distribution[J].Circulation,2003,108(7):863-868.

[35]Ji JF,He BP,Dheen ST,et al.Expression of chemokine receptors CXCR4,CCR2,CCR5 and CX3CR1 in neural progenitor cells isolated from the subventricular zone of the adult rat brain[J].Neurosci Lett,2004,355(3):236-240.

[36]Ma Q,Jones D,Borqhesani PR,et al.Impaired B-lymphopoiesis,myelopoiesis,and derailed cerebellar neuron migration in CXCR4- and SDF-1-deficientmice[J].Proc Natl Acad Sci USA ,1998,95(16):9448-9453.

[37]Tepper OM,Galiano RD,Capla JM,et al.Human endothelial progenitor cells from typeⅡ diabteics exbibit impaired proliferation,adhesion,and incorporation into vascular structures[J].Circulation,2002,106(22):2781-2786.

[38]李士勇,鄧宇斌.SDF-1/CXCR4軸在缺氧缺血性腦損傷中的研究進展[J].生命科學(xué),2008,20(3):463-466.

[39]王心蕊,何 旭,王醫(yī)術(shù),等.低氧促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的實驗研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2006,22(12):1100-1102.

[40]Stellos K,LangerH,Daub K,et al.Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promtoes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells[J].Circulation,2008,117(2):206-215.

[收稿日期]2011-10-24 [修回日期]2011-11-18

編輯/李陽利