喉外傷后聲帶瘢痕形成機制的實驗研究

潘葉挺　鄒堅定　龔梁　陳建強

[摘要] 目的 通過研究兔聲帶損傷后不同時期的組織病理學改變、上皮增殖活性及主要細胞外基質(zhì)（ECM）的變化，探討聲帶瘢痕形成機制。 方法 實驗用兔聲帶銳性損傷后1周～6個月，通過HE染色、免疫組化染色、ELISA測定及Masson染色法，觀察聲帶組織學結(jié)構(gòu)變化、上皮增殖活性及固有層內(nèi)透明質(zhì)酸、膠原纖維等主要ECM的分布及含量變化。 結(jié)果 兔聲帶損傷后3個月內(nèi)上皮增殖活性增強；6個月內(nèi)膠原纖維含量明顯高于正常對照組（P < 0.05）；透明質(zhì)酸增加不明顯。 結(jié)論 兔聲帶損傷后早、中期各種ECM分泌增加，主要表現(xiàn)為以膠原為主的纖維組織明顯增多且呈無序排列，透明質(zhì)酸增加不明顯；在損傷后期膠原持續(xù)高于正常，導致聲帶局部瘢痕形成。

[關鍵詞] 聲帶瘢痕；細胞外基質(zhì)；組織學

[中圖分類號] R739.65[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）29-0016-03

近年來，耳鼻咽喉外傷逐漸增多，聲帶損傷后瘢痕形成是永久性嗓音障礙的難治原因之一，嚴重者將出現(xiàn)喉腔粘連、狹窄，甚至引起呼吸困難，將嚴重影響患者的正常工作、社交和生活，但迄今尚無針對瘢痕本身的有效治療。這一問題長期以來一直困擾著臨床醫(yī)生和患者。近些年來很多國內(nèi)外相關研究將目光聚集于聲帶固有層內(nèi)細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）上，越來越多的研究表明，ECM的有序化排列是維持聲帶正常振動的基礎，是干預聲帶疤痕形成的希望。聲帶損傷后ECM的組成和結(jié)構(gòu)改變，纖維組織的大量增生、無序沉積、局部攣縮，影響聲帶形態(tài)、振動及聲門閉合，往往引起不可逆的變化[1，2]。我們從2011年1月開始，通過研究兔聲帶損傷后不同時期的組織病理學改變、上皮增殖活性及主要ECM（膠原纖維、透明質(zhì)酸）的變化特點，了解聲帶自身的修復特點，為聲帶損傷后選擇合理的治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

新西蘭白兔25只（上海醫(yī)科院，普通級），雌雄不限，體重2.5～3.0 kg，采用隨機數(shù)字表法分為兩組，創(chuàng)傷組20只，對照組5只。

1.2主要試劑

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Rapid Bio Lab，美國），小鼠抗大鼠增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體（Santa Cruz，美國）。

1.3主要儀器及設備

小號支撐喉鏡（Karl Storz Gmb H，德國），喉刀。

1.4方法

1.4.1喉外傷的兔動物模型的建立[3，4] 手術(shù)操作均由同一人完成。創(chuàng)傷組：新西蘭兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉1 mL/kg行靜脈麻醉后，固定于手術(shù)臺上，以支撐喉鏡暴露聲門。用微型喉刀機械切劃聲帶前中部至聲韌帶，造成聲帶機械性損傷。左右側(cè)均同法處理。對照組：聲帶不作創(chuàng)傷處理。

1.4.2 術(shù)后檢測①HE染色：術(shù)后1周、1個月、3個月、6月，分別在創(chuàng)傷組中隨機（采用隨機數(shù)字表法）抽取5只新西蘭兔處死，將喉取出，可獲得40份聲帶標本，術(shù)后6個月后處死對照組5只新西蘭兔，獲得10份聲帶標本。從手術(shù)損傷部位切取1 mm×1 mm×1 mm的聲帶黏膜組織，于4%甲醛中固定后，清水漂洗，石蠟包埋后切片，片厚4 μm，行蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察。②透明質(zhì)酸（HA）檢測：將各時間點所取50份聲帶標本中手術(shù)損傷部位切取0.1 g的聲帶黏膜組織（重量由電子天平稱得）研磨成組織勻漿。用ELISA測定共計50份樣本中的透明質(zhì)酸（HA）含量。測定具體步驟按試劑盒說明書進行，在酶標儀上讀取吸光度（A）值，通過標準曲線換算成相應質(zhì)量濃度，結(jié)果以pg/mg表示。③上皮細胞增殖強度檢測：標本切片后采用免疫組化法檢測聲帶黏膜上皮中的PCNA表達。具體步驟：組織石蠟切片，厚4 μm，60℃恒溫箱內(nèi)烤片1 h。二甲苯脫蠟和水化，酒精梯度脫二甲苯，蒸餾水清洗。微波法修復抗原，置于3% H2O2溶液中室溫下孵育30 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS液洗，滴加正常血清封閉液，37℃孵育10 min。滴加一抗PCNA抗體，4℃過夜，PBS清洗。滴加二抗（生物素化羊抗鼠抗體），37℃孵育20 min，PBS清洗。加鏈霉菌生物素—過氧化物酶溶液，37℃孵育20 min，PBS清洗。DAB顯色劑顯色，蘇木素復染，片烤干，封片，光鏡下觀察。免疫組化檢測結(jié)果的觀察及判斷細胞計數(shù)：以細胞核呈彌漫棕黃色細小顆粒為陽性細胞，每張切片上皮層隨機取8幅視野，采用全自動圖像分析儀對陽性細胞進行計數(shù)，在400倍顯微鏡下記錄每視野（10 814 μm2）中的陽性細胞數(shù)。④膠原纖維沉積量的檢測：標本切片后采用Masson染色法測聲帶黏膜下固有層中的膠原纖維沉積情況。具體步驟：10%甲醛液固定組織，石蠟切片，蘇木素染液5～10 min，1%鹽酸分化，流水沖洗數(shù)分鐘，Masson復合染色液5～10 min，1%磷鎢酸液處理約5 min，亮綠染色液（或苯胺藍液）復染5 min，1%冰醋酸水處理1 min，95%酒精、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。⑤膠原纖維定量分析：取Masson染色的組織切片，每張切片分別于固有層淺、中、深層各取3幅視野，采用德國KONTRON 131AS 2.5全自動圖像分析系統(tǒng)對膠原纖維進行定量分析，于200倍顯微鏡下分析其各自的面密度（目標面積/統(tǒng)計場總面積），統(tǒng)計場總面積為44 783 μm2。

1.5統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料用（x±s）表示，創(chuàng)傷組術(shù)后1周、1個月、3個月、6個月分別與對照組相比較，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P < 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

術(shù)后1個月的HE染色結(jié)果示：聲帶黏膜為復層鱗狀上皮，外傷后創(chuàng)傷組觀察到上皮下固有層較多炎癥細胞浸潤，成纖維細胞增生，膠原纖維增厚、增多，呈團狀、漩渦狀，間質(zhì)水腫、變性。見圖1。

2.2 兩組間透明質(zhì)酸（HA）的比較

提示創(chuàng)傷后透明質(zhì)酸（HA）在1個月內(nèi)略增高，3個月后呈下降趨勢，但創(chuàng)傷組各個時間點與對照組差異均無統(tǒng)計學意義（術(shù)后1周、1個月、3個月、6個月分別為t = 1.47、0.40、-0.15、-0.77，P = 0.159、0.697、0.886、0.453），詳見表1。

2.3上皮細胞增殖強度檢測

免疫組化染色示PCNA定位于細胞核內(nèi)，細胞核呈棕黃色反應，胞漿和胞膜不著色。PCNA陽性細胞主要位于上皮基底層，提示創(chuàng)傷后上皮細胞增殖較活躍。創(chuàng)傷組1個月時上皮基底層PCNA著色明顯較對照組深（圖2），提示創(chuàng)傷后聲帶黏膜上皮增殖增強。創(chuàng)傷后1周及1個月時創(chuàng)傷組PCNA陽性細胞數(shù)與對照組比較差異顯著，有統(tǒng)計學意義（術(shù)后1周、1個月分別為t = 3.65、6.54，P = 0.002、0.000），創(chuàng)傷后3個月及6個月時創(chuàng)傷組PCNA陽性細胞數(shù)與對照組比較雖略有增高，但差異無統(tǒng)計學意義（術(shù)后3個月、6個月分別為t = 1.69、0.56，P = 0.108、0.583），詳見表1。

2.4 膠原纖維觀察及定量分析

損傷1周后部分損傷聲帶出現(xiàn)纖維組織增生或膠原紊亂沉積，3個月后達到高峰，6個月時膠原纖維增生及沉積情況趨于穩(wěn)定，膠原含量在損傷后各時期均明顯高于正常對照組（術(shù)后1周、1個月、3個月、6個月分別為t = 2.39、3.61、7.87、4.47，P = 0.028、0.002、0.000、0.000），詳見表1。Masson染色示組織中肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色?？梢妱?chuàng)傷組組織中大量膠原纖維增生，排列較紊亂，有的成團或成束，有的扭曲纏繞。見圖3。

表1 各組透明質(zhì)酸（HA）、上皮細胞增殖強度、膠原纖維比較（x±s）

注：與對照組比較，*P > 0.05，**P < 0.05，***P < 0.01

3討論

聲帶固有層是介于聲帶上皮層與聲帶肌之間的結(jié)締組織，是與聲帶振動密切相關的最重要的特征性結(jié)構(gòu)。根據(jù)分子類型，ECM成分可分為纖維蛋白、間隙蛋白及其他分子如碳水化合物、脂質(zhì)等。纖維蛋白包括彈性纖維和膠原纖維，其中彈性纖維賦予組織彈性，與聲帶變形和回復等聲帶振動特性相關；膠原纖維為組織提供結(jié)構(gòu)和力量，受力時可承受壓力、抵抗變形。間隙蛋白圍繞在彈性成分周圍，包括透明質(zhì)酸和纖維連接蛋白。成纖維細胞則是分泌聲帶ECM的主要細胞。因此，本研究通過長期動態(tài)觀察兔聲帶損傷后不同時期的組織病理學改變、上皮增殖活性及主要ECM（膠原纖維、透明質(zhì)酸）的變化特點，以了解聲帶自身的修復特點。

聲帶創(chuàng)傷愈合中組織修復的特征是修復細胞處于活躍的增殖狀態(tài)。本實驗中我們采用PCNA免疫組化染色來衡量修復細胞的增殖活性。結(jié)果顯示，上皮細胞的增殖活性與ECM成分的變化相吻合。在聲帶創(chuàng)傷后1個月內(nèi)，上皮細胞保持很活躍的增殖狀態(tài)，而此時主要ECM（膠原纖維、透明質(zhì)酸）的明顯增多，成正相關。相似的結(jié)果也見于Guqatschka M的研究[5]，其增殖活性可持續(xù)3個月左右。因此，本研究表明，ECM成分變化與聲帶創(chuàng)傷愈合過程中上皮細胞的增殖能力有關。

固有層中膠原纖維的增加在聲帶損傷后明顯，特別是在3個月時。正如Branski RC等[6]的研究結(jié)果表明，聲帶損傷后初期，膠原纖維和纖維連接蛋白升高，彈性纖維減少。當聲帶損傷時各種ECM的分泌和釋放逐漸增加，ECM對聲帶的自身修復有一定的促進作用；但過度分泌的ECM可能會影響聲帶的修復能力，主要表現(xiàn)為損傷后1個月即出現(xiàn)的以膠原為主的纖維組織的增生及沉積，其持續(xù)的增生狀態(tài)保持至損傷后6個月，膠原纖維作為組織的支撐結(jié)構(gòu)，過度增加的膠原纖維會使聲帶局部僵硬，是導致聲帶瘢痕形成的主要原因之一。在聲帶損傷的中后期，局部組織開始進行重塑[6]，此時期膠原的含量雖略有降低，但仍明顯高于正常，固有層內(nèi)的膠原纖維呈不規(guī)則柱狀或條索狀排列，表明膠原的無序沉積狀態(tài)可能是聲帶瘢痕形成的主要因素。因此，過度分泌及無序沉積的膠原纖維可能導致受損聲帶局部纖維化，從而使聲帶喪失正常的振動功能。

本研究組對固有層內(nèi)主要ECM的檢測顯示，損傷后1個月內(nèi)透明質(zhì)酸（HA）含量略微增加，與對照組比較無顯著差異。HA被認為是維持聲帶正常彈性及聲帶損傷后抑制膠原分泌的主要ECM[7]。Catten等[8]對間隙蛋白進行研究后認為，蛋白聚糖特別是HA對聲帶生物力學具有重要作用，HA濃度越高則聲帶黏性越高，振動緩沖能力越強。提示HA對聲帶黏膜和固有層缺失修復具有潛在的應用價值。HA是一種細胞外基質(zhì)黏多糖，無抗原性，具有黏彈性和吸收沖擊的特性，具有承受聲帶所受振動碰撞的理想的生物機械特性。HA作為減震器，保護聲帶緣在發(fā)聲中不受振動損傷，其促進損傷修復的能力可以減少纖維化和瘢痕形成。此外，HA還在聲帶組織分化、再生、修復中起重要作用[9，10]。我們可以推斷固有層中膠原纖維的含量變化也會影響聲帶的損傷后修復，其含量在中后期的持續(xù)增高直接參與聲帶瘢痕的形成過程，構(gòu)成了聲帶瘢痕一部分，如能在損傷早期適當控制膠原纖維的分泌則有可能促進聲帶的修復。因此，如何誘導成纖維細胞增加HA的分泌，減少膠原纖維的分泌，成為聲帶修復的關鍵所在。

本研究結(jié)果提示，在聲帶損傷后成纖維細胞活性增強，早、中期各種ECM的大量沉積，表現(xiàn)為以膠原纖維為主的纖維組織持續(xù)增生和無序排列、HA少量增多；在聲帶損傷后期各種ECM分泌減少，但膠原纖維含量仍明顯高于正常，聲帶固有層局部的ECM以紊亂的膠原纖維沉積為主，分層結(jié)構(gòu)消失，瘢痕形成，透明質(zhì)酸成分降低。

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（收稿日期：2012-07-30）