大豆（Glycine max（L.）Merr.）葉片抗氧化酶對(duì)干旱及復(fù)水的響應(yīng)機(jī)制

王文斌，王曉怡，張明輝，胡曉婕，栗相如

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷030801；2.中國(guó)科學(xué)院水利部水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100）

干旱是世界上許多地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最大威脅之一。有研究表明，由干旱造成的危害超過(guò)了其他逆境因子危害的總和［1］。我國(guó)北方地區(qū)屬于大陸性氣候，多數(shù)地區(qū)干旱少雨，特別是春季干旱較為普遍，加之水污染問(wèn)題突出，缺水已成為嚴(yán)重制約國(guó)民經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。

干旱脅迫可以導(dǎo)致植物膜傷害，其原因是由于細(xì)胞自由基代謝的平衡遭到破壞，引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷。植物在長(zhǎng)期的適應(yīng)過(guò)程中，形成了一整套抗氧化酶防御體系，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過(guò)氧化酶（APX）、過(guò)氧化物酶（POD）等。但在不同作物品種及不同脅迫條件下對(duì)各種抗氧化酶試驗(yàn)的結(jié)果卻不盡相同［2，3］。趙海泉等［4］的研究結(jié)果表明，大豆幼苗萎蔫過(guò)程（極度干旱）中，SOD、CAT、POD活性先以較大幅度上升，后急劇下降，膜脂過(guò)氧化加劇，大量電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率增大。王啟明［5］研究則指出，輕度干旱脅迫下，大豆SOD、POD和CAT活性增加，膜透性和丙二醛（MDA）含量增幅較小，隨著干旱脅迫程度的增加，3種酶活性明顯下降，膜透性和MDA含量增幅達(dá)顯著或極顯著水平。可見(jiàn)抗氧化酶是通過(guò)協(xié)同作用來(lái)共同抵抗干旱脅迫誘導(dǎo)的氧化傷害，但在干旱及復(fù)水條件下，哪些抗氧化酶之間相互協(xié)同仍需進(jìn)一步研究。

另外，人們普遍認(rèn)為充分供水與適度控水交替進(jìn)行符合作物生長(zhǎng)環(huán)境，也有利于作物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成。Acevedo等［6］指出，高等植物對(duì)水分脅迫—復(fù)水的響應(yīng)方式是在脅迫解除后存在短暫的快速生長(zhǎng)，以補(bǔ)償部分脅迫造成的損失。Wenker等［7］把水分脅迫后復(fù)水引起的生長(zhǎng)反應(yīng)稱(chēng)為補(bǔ)償生長(zhǎng)或“貯積生長(zhǎng)”，并且認(rèn)為這是對(duì)環(huán)境變化的一種適應(yīng)。補(bǔ)償效應(yīng)在輕度干旱后復(fù)水表現(xiàn)明顯，嚴(yán)重脅迫后復(fù)水補(bǔ)償能力減弱?？梢?jiàn)，研究適度水分虧缺條件下脅迫解除后的補(bǔ)償機(jī)制具有重要的應(yīng)用價(jià)值［8，9］。

本研究利用聚乙二醇6000（PEG－6000）模擬干旱脅迫條件，以抗旱大豆品種晉大74與不抗旱大豆品種晉大75為供試材料，進(jìn)行苗期干旱脅迫與復(fù)水試驗(yàn)。通過(guò)研究干旱脅迫及復(fù)水對(duì)大豆幼苗膜脂過(guò)氧化及抗氧化酶活性的影響，深入探討大豆抗旱及復(fù)水后的補(bǔ)償效應(yīng)機(jī)制。研究結(jié)果將為植物抗旱機(jī)制的研究提供一定的理論依據(jù)，并為生產(chǎn)實(shí)踐中的抗旱栽培技術(shù)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗旱品種晉大74（Glycine max（L.）Merr.Jinda74）和不抗旱品種晉大75（Glycine max（L.）Merr.Jinda75），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院李貴全教授惠贈(zèng)。

1.2 材料培養(yǎng)及處理

選取籽粒飽滿(mǎn)的種子在流水下沖洗20min，5 g·L－1NaClO消毒5min，無(wú)菌水沖洗7～8次，（26±2）℃暗培養(yǎng)3d，再于（26±2）℃、光強(qiáng)350 μmol·m－2·s－1，16h光周期，相對(duì)濕度65%條件下，用1／2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，至三出復(fù)葉完全展開(kāi)后用含10%PEG的1／2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理6d，取葉片進(jìn)行各指標(biāo)測(cè)定。再用1／2Hoagland培養(yǎng)液復(fù)水處理3d，取葉片進(jìn)行各指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)試指標(biāo)及方法

稱(chēng)取約0.1g樣品于研缽中，加入1.0mL 50 mmol·L－1磷酸鉀緩沖液（pH 7.0），冰浴下充分研磨后轉(zhuǎn)入2.0mL離心管，再用1.0mL 50 mmol·L－1磷酸鉀緩沖液沖洗后合并于2.0mL離心管，漩渦儀充分混勻后，4℃、9 000r·min－1離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，置于冰盒，立即測(cè)定蛋白含量、抗氧化酶活性及其它指標(biāo)。

MDA含量參照修改的硫代巴比妥酸（TBA）法［10］測(cè)定?？扇苄缘鞍?、O－2·含量和SOD活性測(cè)定參照路文靜等［11］的方法。APX、CAT、POD活性測(cè)定參照Wang等［12］的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫及復(fù)水對(duì)大豆幼苗葉片MDA含量的影響

由圖1可以看出，晉大74與晉大75大豆葉片中MDA含量因受到干旱脅迫的影響而增加，在脅迫6d后分別較對(duì)照增加了26.76%和43.88%，晉大75的變化達(dá)顯著水平（P＜0.05）。復(fù)水3d后，兩品種處理組MDA含量增幅均較干旱脅迫條件下有所降低，但晉大75變化幅度仍然顯著大于晉大74。

2.2 干旱脅迫及復(fù)水對(duì)大豆幼苗葉片O2－·含量的影響

由圖2可看出，在水分脅迫6d后，晉大74與晉大75葉片O－2·含量均有所增加。晉大74脅迫后較對(duì)照增加23.20%，而晉大75經(jīng)脅迫后較對(duì)照極顯著（P＜0.01），增加41.50%。復(fù)水3d后，晉大74葉片中O－2·含量接近于對(duì)照水平，而晉大75葉片中O－2·含量顯著高于對(duì)照。

圖1 干旱及復(fù)水對(duì)大豆葉片MDA含量的影響Fig.1 Effect of dought stress and rewatering on MDA content of soybean leaves

圖2 干旱及復(fù)水對(duì)大豆葉片O－2·含量的影響Fig.2 Effect of dought stress and rewatering on O－2·content of soybean leaves

2.3 干旱脅迫及復(fù)水對(duì)大豆幼苗葉片SOD活性的影響

由圖3可以看出，晉大74葉片SOD活性在干旱脅迫6d后增加18.71%，晉大75葉片SOD活性降低7.31%。復(fù)水3d后，晉大74葉片中SOD的活性較對(duì)照顯著提高27.2%，而晉大75葉片SOD的活性略低于對(duì)照7.48%。可見(jiàn)兩種大豆SOD對(duì)水分脅迫及復(fù)水響應(yīng)具有明顯差異。

2.4 干旱脅迫及復(fù)水對(duì)大豆幼苗葉片APX活性的影響

圖3 干旱及復(fù)水對(duì)大豆葉片SOD活性的影響Fig.3 Effect of dought stress and rewatering on SOD activity of soybean leaves

由圖4可以看出，干旱脅迫條件下，晉大74和晉大75葉片APX活性均顯著低于對(duì)照，且晉大75降低幅度明顯大于晉大74。復(fù)水3d后，晉大74葉片APX的活性較對(duì)照增加54.84%，顯著極差異（P＜0.01），而晉大75葉片APX的活性與對(duì)照接近。

圖4 干旱及復(fù)水對(duì)大豆葉片APX活性的影響Fig.4 Effect of dought stress and rewatering on APX activity of soybean leaves

2.5 干旱脅迫及復(fù)水對(duì)大豆幼苗葉片CAT和POD活性的影響

由圖5可以看出，與對(duì)照相比，在干旱脅迫6d后，晉大74和晉大75葉片CAT活性均低于對(duì)照，晉大75降低幅度明顯大于晉大74，達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。而復(fù)水3d后，晉大74葉片CAT的活性顯著高于對(duì)照，晉大75CAT的活性與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。由圖6可看出，晉大74與晉大75葉片POD活性無(wú)論在干旱脅迫6d還是復(fù)水3d后與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異。

圖5 干旱及復(fù)水對(duì)大豆葉片CAT活性的影響Fig.5 Effect of dought stress and rewatering on CAT activity of soybean leaves

圖6 干旱及復(fù)水對(duì)大豆葉片POD活性的影響Fig.6 Effect of dought stress and rewatering on POD activity of soybean leaves

3 討論與結(jié)論

植物在遭受干旱脅迫時(shí)可以導(dǎo)致過(guò)量產(chǎn)生活性氧，會(huì)引起細(xì)胞膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，影響細(xì)胞膜的完整性，進(jìn)而抑制植物的生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致植物死亡［13］。作為一種重要的活性氧，O－2·含量在干旱脅迫條件下的升高說(shuō)明干旱脅迫導(dǎo)致了氧化迸發(fā)的發(fā)生。MDA含量作為檢測(cè)植物細(xì)胞膜受損傷程度的指標(biāo)，經(jīng)常被用于各種逆境脅迫的抗性分析［10］。本研究結(jié)果表明，晉大74和晉大75葉片中的MDA含量在受到干旱脅迫后均高于對(duì)照，且晉大75增加幅度顯著大于晉大74，說(shuō)明晉大75受損傷程度更為嚴(yán)重；復(fù)水處理后，抗旱品種晉大74葉片MDA含量接近于對(duì)照水平，表明其損傷已基本得到恢復(fù)，復(fù)水過(guò)程產(chǎn)生了補(bǔ)償效應(yīng)，而不抗旱品種晉大75的MDA含量仍高于對(duì)照，膜損傷未完全得到修復(fù)。這與李文饒等研究的PEG模擬旱后復(fù)水對(duì)紫花苜蓿莖葉中MDA含量變化的試驗(yàn)結(jié)果相一致［14］。同時(shí)，細(xì)胞膜的損傷程度與O－2·含量呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明O－2·作為一種活性氧分子是導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化的重要原因之一。

關(guān)于植物的耐旱機(jī)制，自由基引起的膜傷害日益受到人們重視。活性氧清除能力是決定細(xì)胞耐脅迫的關(guān)鍵因素，而整個(gè)抗氧化保護(hù)酶系防御能力的變化又取決于SOD、APX、CAT、POD等多種酶彼此協(xié)調(diào)的綜合結(jié)果。已有研究表明，在各種環(huán)境脅迫條件下，抗氧化酶活性增加，且忍耐性品種的酶活性高于敏感品種［12，15，16］。本研究中，干旱脅迫6d后，晉大74葉片中SOD的活性升高，而晉大75葉片中SOD的活性降低，這說(shuō)明抗旱品種在受到干旱脅迫后可以通過(guò)提高SOD活性來(lái)清除活性氧自由基，從而避免其對(duì)細(xì)胞造成的傷害；盡管兩種大豆葉片中的APX、CAT活性均低于對(duì)照，表明干旱脅迫下APX、CAT對(duì)H2O2清除能力減弱，但晉大74的降低幅度仍小于晉大75，相對(duì)于不抗旱品種，晉大74具有相對(duì)較強(qiáng)的抗氧化能力。

高等植物對(duì)水分脅迫—復(fù)水的響應(yīng)方式是在脅迫解除后存在短暫的快速生長(zhǎng)，以補(bǔ)償部分脅迫造成的損失。這種補(bǔ)償效應(yīng)是對(duì)環(huán)境變化的一種適應(yīng)［7］。本研究結(jié)果也表明，在復(fù)水3d后，晉大74能夠保持顯著高于對(duì)照的SOD、APX、CAT酶活性，而晉大75中SOD、APX、CAT酶活性相近或略低于對(duì)照。H2O2作為另一種活性氧，也是SOD在歧化O－2·過(guò)程中的副產(chǎn)物，可進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷，因此必須在隨后的反應(yīng)中通過(guò)相應(yīng)的活性氧清除系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)化成H2O而清除。本研究中，抗旱品種晉大74在復(fù)水過(guò)程中不僅能保持較高的SOD活性用于清除O－2·，又有相應(yīng)的APX、CAT與SOD協(xié)同作用，以進(jìn)一步保障對(duì)H2O2的清除，最大程度的避免活性氧對(duì)細(xì)胞膜的傷害，這也與復(fù)水過(guò)程中抗旱品種較低的MDA含量相一致，這也可能正是抗旱品種產(chǎn)生補(bǔ)償效應(yīng)的部分原因。陸燕元等［17］對(duì)轉(zhuǎn)基因甘薯旱后復(fù)水的研究中也發(fā)現(xiàn)SOD、APX具有相似的協(xié)同作用，這與本研究結(jié)果相一致。

此外，本研究結(jié)果中，兩種大豆葉片POD酶活性無(wú)論在干旱還是復(fù)水過(guò)程中與對(duì)照相比，均未表現(xiàn)出顯著差異，表明葉片中活性氧的清除可能與POD并不直接相關(guān)，從POD酶活性的絕對(duì)值上分析，也遠(yuǎn)低于相關(guān)文獻(xiàn)根中POD活性數(shù)值，推測(cè)POD活性具有顯著的器官差異性，這也與王文斌等［12，15，16］對(duì)干旱、鹽漬、低溫脅迫下苜蓿幼苗 POD活性的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，抗旱品種晉大74和不抗旱品種晉大75葉片抗氧化酶對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式。較低的膜脂過(guò)氧化水平說(shuō)明晉大74具有較強(qiáng)的自由基清除能力及保護(hù)機(jī)制。晉大74的耐旱性及復(fù)水過(guò)程中較強(qiáng)的修復(fù)能力與葉片中被誘導(dǎo)的較強(qiáng)的SOD、APX、CAT活性密切相關(guān)，并導(dǎo)致較低含量的O－2·及膜脂過(guò)氧化水平，進(jìn)一步降低干旱脅迫對(duì)幼苗的傷害。

［1］Chen T H，Murata N.Enhancement of tolerance of abiotic stress by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes［J］.Current Opinion in Plant Biology，2002，5（3）：250－257.

［2］章崇玲，曾國(guó)平.干旱脅迫對(duì)菜薹葉片保護(hù)酶活性和膜脂過(guò)氧化的影響［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2000，9（4）：23－26.

［3］何冰，許鴻源，陳京.干旱脅迫對(duì)甘薯葉片質(zhì)膜透性及抗氧化酶類(lèi)的影響［J］.廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，12（4）：287－290.

［4］趙海泉，洪法水，吉軍政.大豆幼苗萎蔫過(guò)程中保護(hù)酶活性的變化［J］.中國(guó)油料，1997，19（4）：40－41.

［5］王啟明.干旱脅迫對(duì)大豆苗期葉片保護(hù)酶活性和膜脂過(guò)氧化作用的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（4）：918－921.

［6］Acevedo E.Immediate and subsequent growth responses of maize leaves to changes in water stress［J］.Plant Physiol，1971，48：631－636.

［7］Wenker W.Leaf elongation and turgor maintenance at low water potentials in the elongation region of maize leaves［J］.Agronomy Journal，1978，70：761－764.

［8］郭賢士.谷子旱后的補(bǔ)償效應(yīng)研究［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，1999，10（5）：563－566.

［9］郭相平，張烈軍，王琴，等.拔節(jié)孕穗期水分脅迫對(duì)水稻生理特性的影響［J］.干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2006，24（2）：125－129.

［10］Puckette M C，Weng H，Mahalingam R.Physiological and biochemical responses to acute ozone－induced oxidative stress in Medicago truncatula［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2007，45（1）：70－79.

［11］路文靜.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2012.

［12］Wang W B，Kim Y H，Lee H S，et al.Analysis of antioxidant enzyme activity during germination of alfalfa under salt and drought stresses［J］.Plant Physiology and Biochemistry.2009，47（7）：570－577.

［13］Foyer C H，Noctor G.Oxidant and antioxidant signalling in plants：A re－evaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context［J］.Plant Cell Environment，2005，28：1056－1071.

［14］李文饒，張歲岐，山侖，等.PEG模擬旱后復(fù)水對(duì)紫花苜蓿莖葉生理生態(tài)特性的影響［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（6）：247－252.

［15］Wang W B，Kim Y H，Lee H S，et al.Differential antioxidation activities in two alfalfa cultivars under chilling stress［J］.Plant Biotechnology Reports，2009，3（4）：301－307.

［16］王文斌，金潤(rùn)熙，鄧西平，等.苜蓿幼苗芽、根器官對(duì)鹽脅迫的生理生化響應(yīng)［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，37（5）：217－223.

［17］陸燕元，鄧西平.轉(zhuǎn)入Cu／Zn SOD和APX基因?qū)Ω适砗岛髲?fù)水的恢復(fù)作用［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，38（1）：67－74.