NaOH-過氧乙酸預處理白酒丟糟多酶復配糖化研究

陳 喆 ，楊 健，鐘 霞，張 健,2，吳正云，張文學,3 *，伍學明,4，徐 義，楊 莉

（1.四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都 610065；2.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川 宜賓 644005；3.四川大學 錦江學院白酒學院，四川 眉山 620860；4.四川省調味品添加劑工程技術研究中心，四川 眉山 620010）

白酒丟糟是固態(tài)法生產(chǎn)白酒的主要副產(chǎn)物[1]，粗略推算我國年產(chǎn)白酒丟糟達2400萬t。大量丟糟如果不及時處理，就會腐敗變質，不僅浪費寶貴資源，還會嚴重污染環(huán)境[2-3]。白酒丟糟富含淀粉、纖維素和半纖維素等碳水化合物，據(jù)估計，如果利用白酒丟糟生產(chǎn)燃料酒精，白酒行業(yè)每年可增加產(chǎn)值90億元～150億元[4]。

由于白酒丟糟結構復雜很難被降解，為提高酶水解效率首先要進行預處理。ZHAOX B等[5]用纖維素酶和β-葡萄糖苷酶糖化經(jīng)NaOH-過氧乙酸預處理的甘蔗渣，證明NaOH-過氧乙酸預處理是較合適的預處理方法。與其他預處理方法相比，NaOH-過氧乙酸預處理條件溫和、工藝簡單，且能將物料中的纖維素、半纖維素和木質素有效分離，產(chǎn)生較少抑制物[6-7]。

纖維素酶的主要組分是葡萄糖內(nèi)切酶、葡萄糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。只有當這3個主要組分的活性比例適當時，才能協(xié)同完成對纖維素的高效降解[8-9]。如果再添加β-葡萄糖苷酶，會顯著提高纖維素酶糖化效率[10-11]。而完全降解半纖維素需要半纖維素酶和木聚糖水解酶系協(xié)同完成[12]。半纖維素被木聚糖酶水解后，可降低物料對纖維素酶的無效吸附，提高單糖產(chǎn)率。且阿拉伯糖酶、果膠酶及淀粉酶等酶能有效降解阿拉伯糖、果膠及淀粉等多糖，提高酶水解液可發(fā)酵糖濃度。ZHOU J等[13]將7種純化酶用于糖化經(jīng)蒸汽爆破預處理的玉米秸稈，所得水解液葡萄糖含量15.5g/L，是單用纖維素酶糖化的2.1倍。TABKA MG等[14-18]也對多酶復配做了大量的研究。

目前，國內(nèi)外對生物質材料生產(chǎn)燃料酒精的研究多集中在不同預處理方法對單酶糖化效果的影響上，而對多酶復配糖化效果的研究少見報道。在本研究中，以NaOH-過氧乙酸預處理的白酒丟糟為原料，探討了6種酶復配糖化的工藝，為進一步利用生物質材料降解糖制備燃料酒精、食用酒精、食用冰醋酸以及焦糖色的工藝提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

白酒鮮丟糟（水分含量65%，冷凍保存，使用前置于105℃烘箱干燥12h）四川水井坊股份有限公司，水分6.49%、灰分12.61%、熱水抽提物12.63%、1%NaOH抽提物21.24%、苯-乙醇抽提物7.74%、酸溶性木素5.84%、綜纖維素60.05%、纖維素32.03%、半纖維素19.21%、木質素18.61%；

纖維素酶NS22086（FPU酶活為25.47IU/mL）、β-葡萄糖苷酶NS22118（酶活為15.12IU/mL）、木聚糖酶NS22083（酶活為17.08IU/mL）、葡糖淀粉酶NS22035（酶活為11.54IU/mL）、復合酶NS22119（其中主要的β-葡萄糖苷酶酶活為6.77IU/mL）和復合酶NS22002（其中主要的β-葡萄糖苷酶酶活為3.63IU/mL，木聚糖酶酶活為3.14IU/mL）諾維信天津分公司；

葡萄糖試劑盒：長春匯力生物技術有限公司；木糖、間苯三酚、氫氧化鈉、過氧乙酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 NaOH-過氧乙酸預處理

將100g白酒干丟糟和2%NaOH以固液比1:10（w:v）混合均勻，于85℃水浴90min，濾渣用溫水洗至中性，于60℃烘至恒重，稱重；再將100g處理過丟糟和6%過氧乙酸以固液比1:5（w:v）混合均勻，于75℃處理90min，濾渣用溫水洗至中性，于60℃烘至恒重備用。

1.2.2 白酒丟糟酶解的單因素試驗

采用經(jīng)預處理后干燥的白酒丟糟為底物，對酶解底物濃度及6種酶（以纖維素酶NS22086為主，補充β-葡萄糖苷酶NS22118、木聚糖酶NS22083、復合酶NS22119、復合酶NS22002和葡糖淀粉酶NS22035）添加量分別采用單因素試驗法進行探討。其中復合酶NS22119包括β-葡萄糖苷酶、阿拉伯糖酶、木聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和木糖酶；復合酶NS22002主要包括木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，附加纖維素酶、半纖維素酶和己糖酶。

在試驗中，用檸檬酸緩沖液（pH4.8～5.0）調節(jié)底物濃度，添加2%疊氮化鈉1mL，于50℃、120r/min的搖床糖化48h，離心得上清液。將上清液稀釋一定倍數(shù)后，測定酶解液總糖、葡萄糖和木糖濃度及產(chǎn)率，并以此作為實驗結果評價指標，確定各種酶對多酶糖化過程的貢獻程度。試驗結果的差異顯著性分析采用F檢驗。

1.2.3 添加不同酶酶解白酒丟糟試驗

采用經(jīng)預處理后干燥的白酒丟糟為底物，添加檸檬酸緩沖液（pH4.8～5.0）調節(jié)底物濃度14%（w/v），在添加1mL 2%疊氮化鈉的基礎上，分別添加A-0.20mL/g NS22086；B-0.20mL/g NS22086和0.10mL/g NS22118；C-0.20mL/g NS22086、0.10mL/g NS22118和0.02mL/g NS22083；D-0.20mL/g NS22086、0.10mL/g NS22118、0.02mL/g NS22083和 0.04mL/g NS22119；E-0.20mL/g NS22086、0.10mL/g NS22118、0.02mL/g NS22083、0.04mL/g NS22119 和0.04mL/gNS22002；F-0.20mL/gNS22086、0.10mL/gNS22118、0.02mL/g NS22083、0.04mL/g NS22119、0.04mL/g NS22002和0.02mL/g NS22035。于50℃、120r/min的搖床糖化48h，離心得上清液。將上清液稀釋一定倍數(shù)后，測定酶解液總糖、葡萄糖、木糖濃度及產(chǎn)率，并以此作為實驗結果評價指標。

1.2.4 分析方法

原料及NaOH-過氧乙酸預處理后的固體成分分析：水分、灰分、熱水抽出物、1%NaOH抽提物、有機溶劑抽提物、酸不溶木素、綜纖維素測定分別按GB/T 2677.2-93、GB/T 2677.3-93、GB/T 2677.4-93、GB/T 2677.5-93、GB/T 2677.6-94、GB/T 2677.8-94、GB/T 2677.10-95進行；纖維素、半纖維素和木質素的分析參照NREL法測定[19]。

酶解液分析：酶解液中總糖采用DNS法測定[20]；葡萄糖采用試劑盒法；木糖采用間苯三酚法測定[21]。酶解液中總糖（以還原糖計）、葡萄糖及木糖產(chǎn)率計算：

式中：y 為酶解液中總糖、葡萄糖或木糖產(chǎn)率，mg/g；m 為酶解液中總糖、葡萄糖或木糖質量，g；0.9為修正系數(shù)；w 為經(jīng)NaOH-過氧乙酸預處理白酒丟糟干重，g。

每組試驗做3次重復，以平均值作為分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 白酒丟糟預處理

附表 原料及預處理后白酒丟糟的化學組成Attached table Chemical composition of raw and pretreated spent grains of China spirits

白酒丟糟經(jīng)NaOH-過氧乙酸預處理后化學組成發(fā)生了較大變化。由附表可以看出，預處理后100g白酒丟糟可得63.55g固體產(chǎn)物。纖維素及半纖維素的質量分數(shù)分別為48.47%、19.99%，而木質素質量分數(shù)僅為8.23%。與未處理的原料相比，只有極少的纖維素發(fā)生了水解，絕大部分纖維素保留在固體中，纖維素回收率達到96.20%；小部分半纖維素被溶解，大部分半纖維素保留在固體中，半纖維素回收率達到66.10%；而絕大部分木質素被溶解或分解在NaOH-過氧乙酸預處理液中，木質素的去除率為71.90%。試驗結果表明，NaOH-過氧乙酸預處理有效地解除了白酒丟糟中木質素對纖維素及半纖維素的束縛，為纖維素及半纖維素進一步酶解創(chuàng)造了有利條件。

2.2 酶解白酒丟糟

2.2.1 底物濃度對酶解白酒丟糟的影響

改變底物濃度6%、8%、10%、12%、14%、16%（預處理后干白酒丟糟（w/v），下同），添加0.1mL/g纖維素酶NS22086，進行白酒丟糟酶解試驗，結果見圖1。

由圖1可以看出，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度隨底物濃度的增加，呈現(xiàn)逐漸提高的趨勢；當?shù)孜餄舛葹?4%時，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度分別達到25.43g/L、11.22g/L和10.03g/L；當?shù)孜餄舛却笥?4%時，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度幾乎未增加。CARA C等[22]利用纖維素酶糖化經(jīng)蒸汽處理的甘蔗渣獲得了類似的結果。為了提高酶解液中可發(fā)酵糖濃度，需要增加底物濃度。但是底物濃度過高導致酶解過程攪拌困難和酶解抑制劑濃度較高[23]。對該因素進行方差分析，其p<0.05，說明底物濃度對酶解白酒丟糟有顯著影響。

圖1 底物濃度對酶解白酒丟糟效果的影響Fig.1 Influence of substrate concentration on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

2.2.2 纖維素酶NS22086添加量對酶解白酒丟糟的影響

底物濃度14%，分別添加0.05mL/g、0.10mL/g、0.15mL/g、0.20mL/g、0.30mL/g纖維素酶NS22086進行丟糟酶解試驗，結果見圖2。

圖2 NS22086添加量對酶解白酒丟糟效果的影響Fig.2 Influence of NS22086 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由圖2可以看出，隨著NS22086添加量的增加，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度，呈現(xiàn)漸增的趨勢。當NS22086添加的量為0.20mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度達到41.33g/L、26.43g/L和11.95g/L；當NS22086添加量大于0.20mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度增加不多。對該因素進行方差分析，其p<0.01，說明NS22086添加量對酶解白酒丟糟有極顯著影響。

另外計算結果表明，酶解液中葡萄糖與木糖濃度之和低于總糖濃度，由此推測糖化水解液中還存在寡糖（如纖維二糖等）。這與ZHAOX B等[5]用纖維素酶和β-葡萄糖苷酶糖化經(jīng)NaOH-過氧乙酸預處理的甘蔗渣的試驗結果類似。因此，在后續(xù)試驗中補充β-葡萄糖苷酶進一步水解纖維二糖等寡糖，并消除寡糖對酶解過程的抑制。

2.2.3 β-葡萄糖苷酶NS22118添加量對酶解白酒丟糟的影響

底物濃度14%，在添加0.20mL/g纖維素酶NS22086基礎上，分別添加0.01mL/g、0.05mL/g、0.10mL/g、0.15mL/g、0.20mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118進行白酒丟糟酶解試驗，結果見圖3。

圖3 NS22118添加量對酶解白酒丟糟效果的影響Fig.3 Influence of NS22118 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由圖3可以看出，由于纖維二糖等寡糖是纖維素酶水解過程主要抑制物[10-11]，與單獨添加NS22086的酶解液相比，隨著NS22118添加量的增加，酶解液中總糖和葡萄糖濃度，呈現(xiàn)漸增的趨勢；當NS22118添加量為0.10mL/g時，酶解液中總糖和葡萄糖濃度分別達到70.16g/L、40.32g/L，而木糖濃度幾乎未增加；當NS22118添加量大于0.10mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度不再增加。對該因素進行方差分析，其p<0.01，說明NS22118添加量對酶解白酒丟糟有極顯著影響。

2.2.4 木聚糖酶NS22083添加量對酶解白酒丟糟的影響

完全降解半纖維素需要半纖維素酶和木聚糖水解酶系協(xié)同完成[12]。半纖維素被木聚糖酶水解后，可降低物料對纖維素酶的無效吸附，提高單糖產(chǎn)率。因此，底物濃度14%，在添加0.20mL/g纖維素酶NS22086及0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118基礎上，分別添加0.01mL/g、0.02mL/g、0.04mL/g、0.08mL/g、0.16mL/g木聚糖酶NS22083進行白酒丟糟酶解試驗，結果見圖4。

圖4 NS22083添加量對酶解白酒丟糟效果的影響Fig.4 Influence of NS22083 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由圖4可以看出，隨著NS22083添加量的增加，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度，呈現(xiàn)漸增的趨勢；當NS22083添加量為0.02mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度分別達到96.54g/L、51.21g/L和16.87g/L；當NS22118添加量大于0.02mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度幾乎不再增加。

與添加NS22086和NS22118的酶解液相比，當再補充0.02mL/g的NS22083時，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度分別從70.22g/L、40.54g/L和11.35g/L上升至96.54g/L、51.21g/L和16.87g/L。NS22083有效減少了半纖維素對纖維素酶水解的阻礙作用，提高水解過程纖維素的轉化率。對該因素進行方差分析，其p<0.01，說明NS22083添加量對酶解白酒丟糟有極顯著影響。

2.2.5 復合酶NS22119添加量對酶解白酒丟糟的影響

底物濃度14%，在添加0.20mL/g纖維素酶NS22086、0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118及0.02mL/g木聚糖酶NS22083的基礎上，分別添加0.01mL/g、0.02mL/g、0.04mL/g、0.08mL/g、0.16mL/g復合酶NS22119進行白酒丟糟酶解試驗，結果見圖5。

圖5 NS22119添加量對酶解白酒丟糟效果的影響Fig.5 Influence of NS22119 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由圖5可以看出，隨著NS22119添加量的增加，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度，呈現(xiàn)漸增的趨勢；當NS22119添加量為0.04mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度分別達到101.85g/L、54.68g/L和17.11g/L；當NS22119添加量大于0.04mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度不再增加。

與添加NS22086、NS22118和NS22083的酶解液相比，當補充0.04mL/g的NS22119時，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度分別從96.01g/L、51.21g/L和16.33g/L上升至101.85g/L、54.68g/L和17.11g/L。補充NS22119能有效提高酶解液中可發(fā)酵糖濃度。對該因素進行方差分析，其p<0.05，說明NS22119添加量對酶解白酒丟糟有顯著影響。

2.2.6 復合酶NS22002添加量對酶解白酒丟糟的影響

底物濃度14%，在添加0.20mL/g纖維素酶NS22086、0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118、0.02mL/g木聚糖酶NS 22083、0.04mL/g復合酶NS22119基礎上，分別添加0.01mL/g、0.02mL/g、0.04mL/g、0.08mL/g、0.16mL/g復合酶NS22002進行白酒丟糟酶解試驗，結果見圖6。

圖6 NS22002添加量對酶解白酒丟糟效果的影響Fig.6 Influence of NS22002 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由圖6可以看出，隨著NS22002添加量的增加，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度，呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢；當NS22002添加量為0.04mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度分別從達到106.44g/L、56.73g/L和15.89g/L；當NS22002添加量大于0.04mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖、木糖濃度不再提高。

與未添加NS22002的酶解液相比，當補充0.04mL/g的NS22002時，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度分別從101.85g/L、54.68g/L和17.11g/L上升至106.44g/L、56.73g/L和15.89g/L。補充NS22002有效提高酶糖化水解液可發(fā)酵糖濃度。對該因素進行方差分析，其p<0.05，說明NS22002添加量對酶解白酒丟糟有顯著影響。

2.2.7 葡糖淀粉酶NS22035添加量對酶解白酒丟糟的影響

圖7 NS22035添加量對酶解白酒丟糟效果的影響Fig.7 Influence of NS22035 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

底物濃度14%，在添加0.20mL/g纖維素酶NS22086、0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118、0.02mL/g木聚 糖酶NS22083、0.04mL/g復合酶NS22119及0.04mL/g復合酶NS22002基礎上，分別添加0.01mL/g、0.02mL/g、0.04mL/g、0.08mL/g、0.16mL/g葡糖淀粉酶NS22035進行白酒丟糟酶解試驗，結果見圖7。

由圖7可以看出，隨著NS22035添加量的增加，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度，呈現(xiàn)略有增大的趨勢，但其濃度沒有顯著提高；當NS22035添加量為0.02mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度分別達到107.30g/L、57.44g/L和16.53g/L；當NS22035添加量大于0.02mL/g時，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度不再增加。因NaOH-過氧乙酸預處理會除去白酒丟糟中部分淀粉成分或因NS22086、NS22119、NS22118等酶會與NS22035爭奪接觸原料的機會，補充NS22035對酶解液總糖、葡萄糖及木糖濃度沒有顯著的提高。對該因素進行方差分析，其p>0.05，說明NS22035添加量對酶解白酒丟糟沒有顯著影響。

2.3 添加不同酶對酶解白酒丟糟的影響

圖8 添加不同酶對酶解白酒丟糟效果的影響Fig.8 Influence of multi-enzyme complex on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由圖8可以看出，添加0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118，酶解液中總糖、葡萄糖濃度分別從41.33g/L、26.43g/L上升至70.16g/L、40.32g/L，木糖濃度變化較??；再添加0.02mL/g木聚糖酶NS22083后，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度均有較大提高，其濃度分別從70.16g/L、40.32g/L和11.65g/L上升至96.77g/L、51.42g/L和16.33g/L；再依次添加0.04mL/g復合酶NS22119、0.04mL/g復合酶NS22002和0.02mL/g葡糖淀粉酶NS22035后，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度均有不同程度提高，但增幅較小，這是由于復合酶中阿拉伯糖酶、果膠酶及淀粉酶等酶能有效降解物料中的阿拉伯糖、果膠及淀粉等多糖，以致總糖濃度有所提高，但復合酶與原料接觸降低了纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶與原料接觸的機會。

同 時 添 加0.20mL/g NS22086、0.10mL/g NS22118、0.02mL/g NS22083、0.04mL/g NS22119、0.04mL/g NS22002和0.02mL/g的NS22035 6種酶，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖濃度均達到較好水平，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度分別達到107.30g/L、57.44g/L和16.53g/L，對應糖產(chǎn)率分別為659.13mg/g、317.22mg/g和96.01mg/g。這與ZHOU J等[13]將7種純化酶用于糖化經(jīng)蒸汽爆破預處理的玉米秸稈相比，所得水解液葡萄糖濃度（57.44g/L）將近其酶解液葡萄糖濃度（15.5g/L）的3.5倍；且與TABKA MG等[14-18]對多酶復配做了大量的研究的試驗結果略優(yōu)。

3 結論

（1）白酒丟糟經(jīng)NaOH-過氧乙酸預處理（2%NaOH，固液比1:10（w:v），85℃、90min；6%過氧乙酸，固液比1:5（w:v），75℃、90min），固體中96.20%纖維素被保留，71.90%木質素被去除。這有效地解除了木質素對纖維素及半纖維素的束縛，為進一步高效酶解創(chuàng)造了有利條件。

（2）多酶復配糖化經(jīng)NaOH-過氧乙酸預處理的白酒丟糟，其糖化效果比單一纖維素酶糖化效果好。在添加纖維素酶NS22086的基礎上，補充β-葡萄糖苷酶NS22118或木聚糖酶NS22083時，酶解液中可發(fā)酵糖濃度均有顯著提高；進一步補充復合酶NS22119或復合酶NS22002時，酶解液中可發(fā)酵糖濃度均有不同程度提高；補充葡萄糖淀粉酶NS22035時，效果不明顯。

（3）底物濃度14%（w/v），在添加0.20mL/g纖維素酶NS22086的基礎上，補充0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118、0.02mL/g木聚糖酶NS22083、0.04mL/g復合酶NS22119、0.04mL/g復合酶NS22002及0.02mL/g葡萄糖淀粉酶NS22035，經(jīng)48h糖化水解，得到酶解液中總糖（以還原糖計）、葡萄糖和木糖濃度分別為107.30g/L、57.44g/L和16.53g/L，酶解液中總糖、葡萄糖和木糖產(chǎn)率分別為659.13mg/g、317.22mg/g和96.01mg/g（預處理后干丟糟）。

（4）從白酒廠可持續(xù)發(fā)展出發(fā)，還需進一步對多酶復配糖化白酒丟糟工藝進行系統(tǒng)優(yōu)化研究，以降低生產(chǎn)成本。

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