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    貓棒束孢真菌液體發(fā)酵工藝研究

    2012-04-13 12:31:34楊喜花張生萬任連生
    中國釀造 2012年11期
    關(guān)鍵詞:棒束三角瓶裝量

    楊喜花,張生萬 *,任連生

    (1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006;2.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006;3.山西省腫瘤研究所比較醫(yī)學(xué)部,山西 太原 030013)

    貓棒束孢(Isaria felina)是從天然冬蟲夏草子實(shí)體中經(jīng)菌種分離后培養(yǎng)得到的一株真菌,經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所郭英蘭教授鑒定為Isaria felina(DC.:Fr.)Fr.,在分類上屬于半知菌綱、叢梗孢目、棒束孢屬。該菌種已被中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(保藏號(hào):CGMCCNO.0706),是一種新的冬蟲夏草菌種。國內(nèi)外目前關(guān)于貓棒束孢的研究報(bào)道較少。郭永霞從貓棒束孢菌絲體中分離純化得到具有抗真菌作用的環(huán)縮肽isarfelin,并對(duì)isarfelin進(jìn)行了理化性質(zhì)的分析、結(jié)構(gòu)鑒定,并發(fā)現(xiàn)isarfelin具有抑制細(xì)菌、抵抗真菌的活性[1]。BAUTER、Deffieux G等從貓棒束孢中提取分離得到環(huán)羧酚酸肽結(jié)構(gòu)的具有殺蟲作用的成分Isariins B,C和D,并對(duì)Isariins B,C和D的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定[2-3]。IKUMOTOT等研究發(fā)現(xiàn)Isaria felina的浸出液對(duì)離體心房有負(fù)收縮效應(yīng),同時(shí)對(duì)電刺激回腸的收縮反應(yīng)及人血小板的凝結(jié)有抑制作用[4]。天然冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥,具有保肺益腎等補(bǔ)益功能[5-6],對(duì)腎臟組織有一定的保護(hù)和修復(fù)作用,臨床上多用于慢性腎病的治療[7],由于天然冬蟲夏草價(jià)格昂貴,現(xiàn)一般多用從天然冬蟲夏草中分離得到的菌種經(jīng)人工培養(yǎng)獲得的菌絲體代替,如百令膠囊、金水寶膠囊等[8]。而我們前期研究結(jié)果表明,貓棒束孢對(duì)腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎衰及甘油誘導(dǎo)的急性腎衰均有很好的治療作用,因此貓棒束孢具有遠(yuǎn)大的開發(fā)應(yīng)用前景,有希望開發(fā)為腎病治療藥物。本文就貓棒束孢的液體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究,從而可以增加貓棒束孢的產(chǎn)量,為工業(yè)化生產(chǎn)貓棒束孢提供一定的參考。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌種

    貓棒束孢菌種,于山西省腫瘤研究所比較醫(yī)學(xué)部保藏。

    1.2 試劑

    蛋白胨,酵母膏,酵母粉,蔗糖,硫酸鎂,磷酸二氫鉀,碳酸氫鈉。

    1.3 主要儀器

    HZ-9310K型全溫振蕩器:太倉市科技器材廠;光學(xué)顯微鏡:日本Olympus CX21FS1;筆式pH計(jì):上海虹益器材儀表有限公司;生物安全柜:青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司;低速冷凍離心機(jī):科大創(chuàng)新股份有限公司KDC-2044;876-1型真空干燥箱:上海新諾儀器廠。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    將一定體積的培養(yǎng)基裝于3000mL三角瓶中,牛皮紙封口,125℃高壓滅菌40min,冷卻至室溫,接入菌種,置于180r/min搖床上,于一定溫度條件下旋轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng),收集發(fā)酵液,將發(fā)酵液于2000r/min離心5min,得菌絲體及上清液,分別于80℃烘24h,測(cè)干重。

    2 結(jié)果

    2.1 培養(yǎng)基的選擇

    將貓棒束孢菌種分別接種于培養(yǎng)基1(蛋白胨0.6%,酵母膏1.2%,蔗糖2.4%,硫酸鎂0.05%,磷酸二氫鉀0.1%,飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5~7.0)和培養(yǎng)基2(蛋白胨0.6%,酵母粉1.2%,蔗糖2.4%,硫酸鎂0.05%,磷酸二氫鉀0.1%,飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5~7.0)中,于26.5℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48h,分別收集菌絲體及上清液,于80℃烘干24h,測(cè)干重。結(jié)果見表1。

    表1 培養(yǎng)基篩選結(jié)果Table 1 Result of screening medium

    由表1可見,使用培養(yǎng)基1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)貓棒束孢,其菌絲體及上清液得率均優(yōu)于培養(yǎng)基2,這與酵母膏與酵母粉的成分不同有關(guān)。酵母粉沒有經(jīng)過分解,是酵母液體純培養(yǎng)干燥后的一種性狀,可以做為蛋白原料理解;而酵母膏的營養(yǎng)物質(zhì)得到過分解,是酵母破壁以后除去酵母細(xì)胞壁以后的細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì),主要成分是氨基酸、肽、核甘酸、B族維生素等,再復(fù)配微量元素、P源等營養(yǎng)元物質(zhì)而成,可按照微生物培養(yǎng)基的概念去理解。

    2.2 培養(yǎng)基裝量的選擇

    將貓棒束孢菌種接種于培養(yǎng)基1裝量分別為1000mL、800mL、500mL、300mL的3000mL的三角瓶中,于26.5℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48h,分別收集菌絲體及上清液,于80℃烘干24h,測(cè)干重。結(jié)果見表2。

    表2 裝量篩選結(jié)果Table 2 Effect of culture medium volume on Isaria felina production

    由表2可見,培養(yǎng)基裝量在500mL以上時(shí),菌絲體及上清液的收率隨著裝量的增加反而降低,而培養(yǎng)基裝量在500mL以下時(shí),菌絲體及上清液的收率卻隨著裝量的增加而增加。培養(yǎng)基裝量為500mL時(shí),菌絲體得率及上清液收率均最高,故采用500mL裝量。

    2.3 溫度對(duì)工藝的影響

    將貓棒束孢菌種接種于培養(yǎng)基1裝量為500mL的300mL三角瓶中,分別于30℃、26.5℃、22℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48h,分別收集菌絲體及上清液,于80℃烘24h,測(cè)干重。結(jié)果見表3。

    表3 溫度篩選結(jié)果Table 3 Effect of culture temperature on Isaria felina production

    由表3可見,在30℃和22℃時(shí)菌絲體生長(zhǎng)較慢,甚至不生長(zhǎng),而在26.5℃時(shí)生長(zhǎng)較佳,說明菌絲體的生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境要求較為嚴(yán)格,在高溫和低溫環(huán)境中不易生長(zhǎng)。

    2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)工藝的影響

    將貓棒束孢菌種接種于培養(yǎng)基1裝量為500mL的3000mL三角瓶中,分別于26.5℃下發(fā)酵培養(yǎng)36h、48h、60h,收集菌絲體及上清液,于80℃烘24h,測(cè)干重。結(jié)果見表4。

    表4 發(fā)酵時(shí)間篩選結(jié)果Table 4 Effect of culture time on Isaria felina production

    由表4可見,發(fā)酵時(shí)間48h時(shí),貓棒束孢菌絲體及上清液產(chǎn)率均較高,而發(fā)酵時(shí)為36h和60h時(shí),貓棒束孢菌絲體及上清液產(chǎn)率均有所降低。

    3 結(jié)論

    經(jīng)過對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基裝量、溫度、發(fā)酵時(shí)間等因素的考察,我們確定了貓棒束孢最佳發(fā)酵工藝:培養(yǎng)基為蛋白胨0.6%,酵母膏1.2%,蔗糖2.4%,硫酸鎂0.05%,磷酸二氫鉀0.1%,飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)整pH值為6.5~7.0;培養(yǎng)基裝量為500mL,發(fā)酵溫度為26.5℃,發(fā)酵時(shí)間為48h。

    [1]GUOYX,LIU QH,NGTB,et al.Isarfelin,a peptide with antifungal and insecticidal activitiesfromIsariafelina[J].Peptides,2005,26(12):2384-2391.

    [2]BAUTER,DEFFIEUX G,MERLET D,et al.New insecticidal cyclodepsipeptides from the fungusIsaria felina.I.Production,isolation and insecticidal propertiesof isariins B,Cand D[J].J Antibiot,1981,34(10):1261-1265.

    [3]DEFFIEUX G,MERLET D,BAUTER,et al.New insecticidal cyclodepsipeptides from the fungus Isaria felina.II.Structure elucidation of isariins B,Cand D[J].J Antibiot,1981,34(10):1266-1270.

    [4]IKUMOTOT,SASAKIS,NAMBA H,et al.Physiologically activecompounds in the extracts from Tochukaso and cultured mycelia ofCordycepsandIsaria[J].Yakugaku Zasshi,1991,111(9):504-509.

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    [6]許惠娟,李時(shí)悅,林云恩,等.人工冬蟲夏草聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對(duì)大鼠肺纖維化的干預(yù)作用[J].中國中藥雜志,2011,36(16):2265-2270.

    [7]LIY,XUE WJ,TIAN PX,et al.Clinical application ofCordyceps sinensison immunosuppressive therapy in renal transplantation[J].Transplant Proc,2009,41(5):1565-1569.

    [8]陳孝文,梁 東,劉華鋒.慢性腎功能衰竭[M].第一版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2006:280.

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