改良Genome shuffling技術(shù)選育埃博霉素B高產(chǎn)菌株

龔國利，陳 松，李 慧，曾 橋

（1.陜西科技大學 生命科學與工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學 資源與環(huán)境學院，陜西 西安 710021）

埃坡霉素（epothilone，Epo）是最初從纖維堆囊菌Soce 90的發(fā)酵液中分離出來的細胞毒化合物，與紫杉醇的生物活性相似，也能穩(wěn)定微管組裝過程而抑制細胞分裂，但兩者在化學結(jié)構(gòu)和來源上完全不同。Epo不易受P-糖蛋白（P-glycoprotein）影響，因而抗腫瘤活性較強、抗腫瘤譜廣。且Epo水溶性較好，不良反應少，化學結(jié)構(gòu)簡單，易修飾[1]。Epo共有8種衍生物，目前關(guān)于Epo A和Epo B的研究較多。纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）形態(tài)多變，次級代謝產(chǎn)物種類繁多，產(chǎn)量低且不穩(wěn)定。

基因組重組（Genome shuffling）技術(shù)是近幾年新發(fā)展起來的一種微生物育種方法，該技術(shù)具有不需要事先知道微生物的遺傳背景，也可以對其進行遺傳育種的突出優(yōu)點，使之成為了一種極其高效的微生物育種方法。Genome shuffling技術(shù)是指將具有不同正突變的不同菌株的全基因組進行隨機重組，快速選育出具有較大改進的雜交菌株的方法。ZHANGYX等[2]已成功地通過基因組改組的方法提高弗氏鏈霉菌的泰樂菌素的產(chǎn)量；RANJAN PATNAKIK R等[3]通過基因組改組技術(shù)使得乳桿菌的耐酸性能有了較大提高；DAINH等[4]通過三輪基因組重排將Sphingobiumchorophenoclicum對劇毒殺蟲劑五氯苯酚的耐受濃度提高了10倍以上，并可將培養(yǎng)基中所含的3mmol/L五氯苯酚完全降解。

本研究對Genome shuffling育種方法進行了改良，其主要特點是在遞歸原生質(zhì)體融合的過程中增加了原生質(zhì)體的誘變過程。并且用改良后Genome shuffling育種方法選育埃博霉素B高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗所采用的出發(fā)菌株So072-21、So072-42、So072-35、So072-67系由原始菌株SoF5-08（埃博霉素B產(chǎn)量為13.8mg/L），經(jīng)UV和DES復合誘變后獲得的高產(chǎn)埃博霉素B的突變株，其產(chǎn)量分別為17.5mg/L、18.5mg/L、18.4mg/L、17.9mg/L。

1.1.2 培養(yǎng)基

CNST培養(yǎng)基：KNO30.05%，Na2HPO40.025%，Mg-SO4·7H2O 0.1%，F(xiàn)eCl30.001%，微量元素液1mL/L，瓊脂2%，pH 7.2。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂2%，pH 7.4。

M26培養(yǎng)基：土豆淀粉0.8%，豆蛋白胨0.2%，葡萄糖0.2%，酵母粉0.2%，MgSO40.1%，CaCl20.1%，EDTA-Fe3+1mL/L，pH 7.2。

再生培養(yǎng)基（VY/2）：活性干酵母0.5%，VB120.5mg/L，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.1%，瓊脂2%，pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精0.3%，蔗糖0.07%，葡萄糖0.02%，豆餅粉0.17%，MgSO4·7H2O 0.17%，無水氯化鈣0.3%，EDTAFe3+2mL/L，TE 0.5mL/L，pH 7.2，XAD-16 2%。

1.1.3 溶液

TPM液：0.01mol/L Tris-HCl，0.001 mol/L K2HPO4-KH2PO4，0.008mol/L MgSO4，pH7.6，滅菌。MMM緩沖液：0.3mol/L甘露醇，0.02mol/L MgCl2·6H2O，0.02mol/L馬來酸，pH6.5滅菌。

Tris緩沖液：0.067mol/L，pH8.0滅菌。

EDTA溶液：80mL水中加入4g EDTA，磁力攪拌器攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至100mL，滅菌。

1.1.4 主要試劑

溶菌酶（lysozyme），購自Sigma公司，溶于MMM緩沖液中，濃度為2mg/mL。用G6細菌濾器過濾除菌后用。

1.2 方法

1.2.1 菌體的培養(yǎng)和收集

首先，將保藏的SoF5-08轉(zhuǎn)接到CNST斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5d～7d，活化2～3次。再在液體M26培養(yǎng)基中活化一次，置于巡回式搖床（200r/min）上，30℃培養(yǎng)7d。培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將培養(yǎng)好的菌液以4000r/min離心10min，收集菌體[5-6]。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備和再生

將出發(fā)菌株的細胞濃度都調(diào)整到1×108cell/mL，懸浮在30mL MMM中，再加入30mL濃度為2mg/mL溶菌酶液?；靹蚝笤?0℃水浴鍋中保溫30min。酶解后，2000r/min離心20min，收集原生質(zhì)體，用MMM緩沖液洗滌一次。重懸于30mL MMM中待用。取0.5mL酶解好的原生質(zhì)體懸液，用MMM緩沖液稀釋，加入到再生培養(yǎng)基VY/2上。30℃恒溫培養(yǎng)7d，直至長出單菌落[7-8]。

1.2.3 原生質(zhì)體融合

取濃度為1×109cell/mL的出發(fā)菌株滅活的原生質(zhì)體懸液各1mL混合，2000r/min離心20min，收集原生質(zhì)體，去上清液后將原生質(zhì)體懸浮于MMM緩沖液中，然后加入2mL 40%的PEG-MMM，30℃水浴保溫15min。離心洗滌，將融合后的原生質(zhì)體重懸于MMM中，采用雙層培養(yǎng)法再生法，于30℃恒溫培養(yǎng)7d。根據(jù)融合子和滅活親本的再生情況計算融合率。

PEG的濃度分別為20%、30%、40%、50%，融合時間為10min；然后在取的的最佳濃度下，對融合時間進行實驗，設5min、10min、15min、20min 4個梯度。

1.2.4 改良后Genomeshuffling

首先進行原生質(zhì)體的制備，將獲得的原生質(zhì)體調(diào)整到1×107cell/mL，在80%致死率下進行UV誘變（30W、235.7nm、15cm、30s），然后收集誘變原生質(zhì)體，進行融合再生，收集全部再生菌落即為F1代融合菌群[9]；再將F1代菌群作為出發(fā)菌株，經(jīng)過誘變、融合、再生、所得的菌株為即為第二輪融合菌群F2代，如此反復進行3輪循環(huán)原生質(zhì)體融合，再生。每將最終融合得到的菌群進行篩選和檢測，從而篩選到埃博霉素B高產(chǎn)菌株[10-11]。其流程：

Genomeshuffling對照組：A.取相同體積和濃度的出發(fā)菌株菌懸液，按照上述1.2.4方法進行操作。但在遞歸原生質(zhì)體融合過程中不對原生質(zhì)體進行UV誘變。B.取相同體積和濃度的出發(fā)菌株菌懸液，按照上述1.2.4方法進行操作。但過程中不加入溶菌酶，也不對原生質(zhì)體進行UV誘變。

1.2.5 高產(chǎn)重組子的初篩

采用高通量篩選方法進行重組子的篩選，在無菌96孔板中的每一個孔加入200μL固體無菌GFM培養(yǎng)基，將誘變菌株平行接種在2塊96孔板上，命名為A板和B板。A板的每一個孔接種后加入一定量的吸附樹脂，30℃培養(yǎng)7d～10d。B板在30℃培養(yǎng)5d后，放在4℃保藏待用。A板培養(yǎng)結(jié)束后，加入200μL甲醇浸提埃博霉素，然后將浸提液轉(zhuǎn)到另一個新的96孔板中，用微板光譜儀閱讀波長250nm處的光吸收值，光吸收值較大的菌株就是目標菌株，再從B板上取出對應的目標菌株進行檢測。

1.2.6 高效液相色譜復篩

把1.2.6步驟獲得的目標菌株用液體M26培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，收獲的菌體用玻璃珠分散后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基。接種量每50mL發(fā)酵培養(yǎng)基接種2×108個細胞。發(fā)酵體系：300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50mL，加1mL吸附樹脂。收集樹脂，干燥待用。

樹脂再用甲醇溶解浸提。采用HPLC對洗脫液進行定性分析和定量測定。色譜條件：Waters高效液相色譜系統(tǒng)；色譜柱，4.6×250mm；柱溫為室溫；流動相為甲醇:水（含0.5%乙酸）為65:35（v/v），紫外檢測儀，波長為250nm[8，12]，流速1.0mL/min，進樣量20μL。同時，以Sigma公司的埃博霉素B標準品對照。

1.2.7 重組子遺傳穩(wěn)定性的測定

對獲得的埃博霉素高產(chǎn)菌株傳代培養(yǎng)5次，然后進行發(fā)酵篩選，選擇遺傳穩(wěn)定性好，埃博霉素B產(chǎn)量高的重組菌株，予以保藏。

2 結(jié)果和分析

2.1 紫外線誘變時間的確定

紫外線致死曲線見圖1。由于現(xiàn)在紫外誘變育種一般都采用較低劑量，以獲得較高的正突變率。根據(jù)紫外線致死曲線，采用80%的致死率所對應的誘變劑量，即用功率為30W的紫外燈，照射距離為15cm的條件下，用紫外線照射30s。

圖1 UV存活曲線Fig.1 Survival rate of protoplast with UV-irradiation

2.2 原生質(zhì)體的制備和再生

原生質(zhì)體制備和再生是基因重排的關(guān)鍵步驟，研究中要確定培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)方法、滲透壓穩(wěn)定劑、酶解時間和溫度以及酶解前的預處理等因素。在制備時，需要用EDTA預處理細胞液，提高細胞壁酶解效率。通過研究，選擇的滲透壓穩(wěn)定劑是0.3mol/L甘露醇，EDTA預處理10min，酶解時間為30min。原生質(zhì)體再生采用的是自然擴展法。

表1 原生質(zhì)體制備條件對制備率的影響Table 1 Effect protoplast preparation conditions on the rate of preparation

2.3 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合條件：PEG的類型、濃度、作用時間和作用溫度對融合率有很大的影響。本研究對這些因素做了系統(tǒng)的優(yōu)化，見表2，發(fā)現(xiàn)作用效果最好的PEG類型是PEG 6000，濃度則為40%（w/v）；原生質(zhì)體的融合率隨著PEG作用時間的增加而增加，但當達到一定的融合率后，繼續(xù)增加融合時間融合率將不再提高；另外融合時間過長將極大地降低融合子的再生率。融合過程中使用的溫度也對融合率產(chǎn)生一定的影響，30℃是一個合適的作用溫度[13]。

表2 原生質(zhì)體融合條件對融合率的影響Table 2 Effect protoplast fusion conditions on the rate of fusion

2.4 改良Genome shuffling選育高產(chǎn)埃博霉素B菌株

出發(fā)菌群的獲得：基因組重排需要在一個具有不同正突變的特定的遺傳多樣性群體中實現(xiàn)隨機基因重組。為獲得具有正突變的出發(fā)菌群庫，本試驗采用UV+DES的3種劑量復合誘變的方法對原始菌株SoF5-09進行誘變，誘變完成后取原液涂布使之生長在分別含埃博霉素和前體的濃度中，30℃培養(yǎng)7d。挑選極限濃度下的生長的菌株，接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用HPLC檢測誘變獲得的菌株產(chǎn)生埃博霉素B的能力。通過誘變共獲得了4株菌對埃博霉素B和前體有抗性，且埃博霉素B產(chǎn)量較原始菌株SoF5-09有所提高的菌株（結(jié)果見表3）。這4株菌（So072-21、So072-42、So072-35、So072-67）作為遞歸原生質(zhì)體融合的出發(fā)菌株。

試驗中對基因重組技術(shù)進行了改良，即每輪融合中對原生質(zhì)體進行了UV誘變。在遞歸原生質(zhì)體融合過程中，每輪融合后取100個再生菌落測吸光度，再選取4株高吸光度值的菌株進行液體發(fā)酵，最后進行定量檢測。經(jīng)過基因重排后，考察了1230株再生平板上的誘變?nèi)诤暇湓?6孔板上的生長情況，其中獲得了10株吸光度值（OD250）超過0.7的融合菌，剩余的1220株融合菌的平均吸光度值（OD250）為0.452，出發(fā)菌株的平均吸光度值（OD250）為0.315。每輪挑選4株高吸光度值的融合菌株進行搖瓶發(fā)酵考察，用HPLC進行定量檢測。最后獲得了2株高產(chǎn)埃博霉素B菌株So073-08和So073-45，產(chǎn)量分別為41.2mg/L、42.5mg/L（結(jié)果見圖2）。

表3 親本菌初篩過程中部分菌株實驗數(shù)據(jù)Table 3 Experiment date in the initial screen process of a part of strains

圖2 Genome shuffling 育種效果圖Fig.2 Effect of breeding by genome shuffling

對照組也同樣進行了3輪遞歸原生質(zhì)體融合，A組中沒有對原生質(zhì)體進行誘變，最終篩選的到菌株埃博霉素B產(chǎn)量最高可達到25.4mg/L。B組中既沒有對原生質(zhì)體誘變，也沒有加入溶菌酶。最后篩選到菌株埃博霉素B產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比無明顯變化。這證實了改良后的基因重組技術(shù)可以有效篩選出埃博霉素B高產(chǎn)菌株，比傳統(tǒng)的genome shuffling育種技術(shù)更高效。

2.5 重排菌株遺傳穩(wěn)定性的測定

將篩選出來的2株高產(chǎn)埃博霉素菌株連續(xù)傳代5次后，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，菌株的特征、顏色、生長速度都無明顯變化。用HPLC分析，菌株發(fā)酵合成埃博霉素B的產(chǎn)量沒有下降（見表4）。表明實驗篩選的重排菌株的高產(chǎn)性狀穩(wěn)定。

表4 高產(chǎn)埃博霉素菌株不同代數(shù)菌株產(chǎn)量Table 4 Epothilone B production of high producing stains from different generation

3 討論

傳統(tǒng)誘變育種方法往往只能是一至幾個基因的作用（也可能是鄰近基因的突變效應），很難大幅度埃博霉素的產(chǎn)量；而Genomeshuffling則是幾個親本菌株在全基因組的不同位置上同時發(fā)生重組，容易發(fā)生多交換和多基因重組，促使不同基因重組到同一個細胞株中，相對容易實現(xiàn)大幅度提高菌株合成的產(chǎn)量。因此，Genomeshuffling技術(shù)能夠比傳統(tǒng)誘變選育更快速的改良菌株，加快人們模仿并加速微生物的進化方式的步伐[14]。

本研究對Genomeshuffling育種技術(shù)進行了改良，在遞歸原生質(zhì)體融合過程中加入了原生質(zhì)體誘變，最后成功選育出了2株產(chǎn)量較穩(wěn)定的高產(chǎn)埃博霉素B菌株。

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