干旱脅迫下黃花苜蓿與蒺藜苜蓿兩個(gè)抑制性差減雜交文庫(kù)的構(gòu)建及分析

王天佐，趙敏桂，張文浩

（中國(guó)科學(xué)院植物研究所植被與環(huán)境變化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100093）

＊水資源缺乏是一個(gè)全球性的問(wèn)題，地球上有1／3以上的陸地是干旱和半干旱地區(qū)，而中國(guó)是主要的干旱國(guó)家之一，干旱半干旱土地面積占國(guó)土面積的50%以上。水分是植物生存所必需的，干旱脅迫會(huì)嚴(yán)重地影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，造成作物大面積減產(chǎn)［1］。干旱對(duì)農(nóng)業(yè)和社會(huì)造成的損失相當(dāng)于其他各類自然災(zāi)害造成的損失之和［2］。日益加劇的水資源短缺與植物的正常生長(zhǎng)之間形成了激烈的矛盾，因此，通過(guò)揭示抗旱植物抵抗脅迫的機(jī)理，以尋找提高植物抗旱能力的途徑勢(shì)在必行。

黃花苜蓿（Medicagofalcata）是一種具有突出經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)功能的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，在我國(guó)分布廣泛，內(nèi)蒙古、新疆分布較多［3］。黃花苜蓿屬于耐寒的旱中生植物，抗旱、耐寒、耐鹽堿、耐風(fēng)沙、耐貧瘠、抗病蟲害。由于黃花苜蓿具有優(yōu)異的抗逆性，所以在苜蓿的育種實(shí)踐中，黃花苜蓿常常作為父本與高產(chǎn)的紫花苜蓿雜交，來(lái)培育苜蓿新品種［4－6］。Pennycooke等［7］對(duì)黃花苜蓿和蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）冷響應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)黃花苜?；蚪M中編碼諸如胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的同源基因較多，并且其上游具有多個(gè)識(shí)別低溫信號(hào)的CRT／DRE元件 （C－repeated／dehydration responsive element motifs），這是黃花苜蓿較蒺藜苜?？估涞姆肿訖C(jī)理之一。另外，在低溫脅迫下，黃花苜蓿體內(nèi)積累的脯氨酸和可溶性糖比蒺藜苜蓿占優(yōu)勢(shì)［8］。黃花苜蓿在低磷脅迫下能通過(guò)大量合成植物激素乙烯，調(diào)控其根系的水分運(yùn)輸和酸性磷酸酶的活性［9，10］，黃花苜蓿還能通過(guò)根系大量分泌檸檬酸，活化根際難溶態(tài)磷來(lái)提高在磷脅迫條件下對(duì)磷的吸收［11］。在水分脅迫下，黃花苜蓿具有形態(tài)學(xué)上的優(yōu)勢(shì)：根系發(fā)達(dá)，入土深度達(dá)2 m，側(cè)根沿水平方向擴(kuò)展；上表皮氣孔小，下表皮氣孔多［3］。干旱脅迫下，黃花苜蓿較其他品種能夠積累更多的可溶性糖，保持較高的光合速率，擁有較強(qiáng)的抗氧化系統(tǒng)［12］。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)黃花苜?？购档纳頇C(jī)理研究已取得一定的成果，但對(duì)其抗旱的分子機(jī)理研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，對(duì)黃花苜?？购捣肿诱{(diào)控機(jī)制的研究是極其有意義和亟待進(jìn)行的。但由于黃花苜蓿遺傳背景比較復(fù)雜，分子生物學(xué)研究稀少，直接對(duì)其進(jìn)行抗旱分子機(jī)理研究存在一定的困難。由于黃花苜蓿與豆科模式植物蒺藜苜蓿有著緊密的親緣關(guān)系，蒺藜苜蓿基因組小、自花授粉、豐富的基因組信息、完善的轉(zhuǎn)化體系［13］以及現(xiàn)有的對(duì)蒺藜苜?？购档难芯浚?4－16］為研究黃花苜蓿抵抗水分脅迫的機(jī)理提供了便利。

抑制性扣除雜交 （suppression subtractive hybridization，SSH）是一種比較和分離不同細(xì)胞系、不同組織間或同一細(xì)胞系、同一組織在不同條件下有差別表達(dá)基因的方法。抑制性消減雜交法是尋找重要功能基因的新方法，它通過(guò)單鏈Tester cDNA的消減均等化，以及兩輪抑制性PCR使高低豐度的差異表達(dá)基因均能有效地進(jìn)行分離，并可同時(shí)得到多條片段［17］。SSH技術(shù)已經(jīng)成功的用于苜蓿差減文庫(kù)的構(gòu)建［18，19］，并廣泛的運(yùn)用于篩選干旱相關(guān)基因的研究［20，21］。本研究利用SSH技術(shù)構(gòu)建了黃花苜蓿和蒺藜苜蓿的2個(gè)差減文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)比較2個(gè)文庫(kù)序列的差異來(lái)分析黃花苜?？购档脑颉?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

蒺藜苜蓿使用測(cè)序種Jemalong A17，黃花苜蓿使用呼倫貝爾野生黃花苜蓿。試驗(yàn)于2008年11月—2009年5月在中國(guó)科學(xué)院植物研究所植被與環(huán)境變化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 材料栽培 選取均勻一致的黃花苜蓿和蒺藜苜蓿種子，用濃硫酸處理，春化后生根。待根長(zhǎng)到1 cm左右時(shí)種到直徑10 cm的小盆中。每盆4株，為求條件一致，2個(gè)品種的苜蓿種于同一盆中，相同品種對(duì)角種植。培養(yǎng)土為蛭石∶泥炭土＝2∶1，各盆中培養(yǎng)土量一致?？刂茥l件（光照14 h／26℃，黑暗10 h／18℃，相對(duì)濕度均為50%），使之正常生長(zhǎng)。

1.2.2 干旱處理 當(dāng)苜蓿在適宜條件下長(zhǎng)至4周時(shí)開(kāi)始處理。先將數(shù)盆苜蓿澆透水開(kāi)始干旱處理，以后每隔數(shù)天依次進(jìn)行干旱處理，最后同時(shí)取樣，干旱處理天數(shù)為4，6，8和10 d。收樣時(shí)，正常生長(zhǎng)的為對(duì)照，將不同干旱時(shí)間地上部樣品等量混合為干旱處理，液氮速凍后存放于－70℃超低溫冰箱。

1.2.3 差減文庫(kù)構(gòu)建 使用RNAiso Plus（Ta KaRa）進(jìn)行總RNA的提取，總RNA經(jīng)檢驗(yàn)沒(méi)有降解后，再使用Poly Tract mRNA Isolation systems（Pormega）對(duì)其中的mRNA進(jìn)行磁珠法分離。

然后使用PCR－SelectTMcDNA Subtraction Kit（Clontech），參照其說(shuō)明書進(jìn)行操作獲得干旱誘導(dǎo)基因的表達(dá)序列標(biāo)簽 （expressed sequence tag，EST）。cDNA的合成：提取干旱處理和正常材料的mRNA分別作為檢測(cè)樣本（tester）和參照樣本（driver），在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將它們的mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA；cDNA的酶切：將tester、driver的雙鏈cDNA分別用RcaⅠ酶切，產(chǎn)生較短的平頭末端；接頭連接：將tester樣本經(jīng)酶切后的cDNA片段分為2份，分別接上接頭－1 （Adapter－1）和接頭－2R （Adapter－2R），形成 Adapter－1－tester－cDNA，Adapter－2R－tester－cDNA；扣除雜交：用過(guò)量的driver加入到 Adapter－1－tester－cDNA 和 Adapter－2R－tester－c DNA 中加熱變性后分別退火雜交，再將第1次雜交后的產(chǎn)物混合，加入新制備的變性drive，再次退火雜交，得到干旱脅迫下特異表達(dá)基因的片段；PCR擴(kuò)增：扣除雜交后的產(chǎn)物需2次PCR才能有效地?cái)U(kuò)增有差別表達(dá)的片段。在PCR反應(yīng)中，只有干旱誘導(dǎo)表達(dá)基因的cDNA片段能以指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

最后將這些片段純化后連接p GEM－T Easy載體（Pormega），轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，菌液PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 將2個(gè)文庫(kù)測(cè)序出的EST片段使用生物序列分析軟件DNA Star進(jìn)行去低質(zhì)量片段、去接頭、去重復(fù)、并進(jìn)行拼接。然后將這些序列使用堿基局部比對(duì)檢索工具BLAST（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／）、基因語(yǔ)義分類GO（Gene Ontology category，http：／／www.geneontology.org／）和京都基因與基因組百科全書KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：／／www.genome.jp／kegg／）進(jìn)行分析。

1.2.5 基因表達(dá)模式分析 從篩選出的干旱響應(yīng)基因中，選取了1個(gè)乙烯響應(yīng)因子（ethylene response factor，ERF）家族的轉(zhuǎn)錄因子基因ERN1（EU038802）以及1對(duì)同源的胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因Mf CAS30（EU139865）和MtCAS31（EU139871），進(jìn)行干旱處理下基因表達(dá)的半定量分析，ERN1半定量引物為5′－GTTAGGCAAAGGCCATCAGG－3′和5′－GCAGAAGCAACAGCACCATC－3′，黃花苜蓿Mf CAS30的半定量引物為5′－CTTGAGCCAAGGCCAAGTT－3′和5′－CTGTCCCTGTACCATACCC－3′，蒺藜苜蓿MtCAS31的半定量引物為5′－ATCAAACACGTAGGGTTG－3′和5′－GGTTCCACCAATGTCAGT－3′。使用Actin（引物為5′－ACGAGCGTTTCAGATG－3′和5′－ACCTCCGATCCAGACA－3′）作為內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個(gè)文庫(kù)的測(cè)序

分別從黃花苜蓿和蒺藜苜蓿差減文庫(kù)中挑取了667和565個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序，得到了515和547條EST序列。經(jīng)過(guò)DNA Star的處理，黃花苜蓿得到391條非冗余序列，包括78條拼接序列和313條單序列；蒺藜苜蓿得到353條非冗余序列，包括57條拼接序列和296條單序列（表1）。

表1 對(duì)照和干旱文庫(kù)的EST統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistics of ESTs for M.falcata andM.truncatula libraries

2.2 序列的生物信息學(xué)分析

Gene Ontology分類包含了基因參與的生物過(guò)程，所處的細(xì)胞位置，發(fā)揮的分子功能三方面信息。在基因表達(dá)譜分析中，GO分類常用于提供基因功能分類標(biāo)簽和基因功能研究的背景知識(shí)。利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)的知識(shí)體系和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，旨在發(fā)掘與基因差異表達(dá)現(xiàn)象關(guān)聯(lián)的單個(gè)特征基因功能類或多個(gè)特征功能基因的組合［22］。GO分類將2個(gè)文庫(kù)的EST序列分成細(xì)胞定位、分子功能和生物功能三大部分，每部分又有細(xì)化（圖1）。

圖1 黃花苜蓿和蒺藜苜蓿EST序列的GO分類Fig.1 GO category of ESTs from M.falcata and M.truncatula libraries

KEGG是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，它有助于研究者把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。基因組信息包括完整和部分測(cè)序的基因組序列，圖解的細(xì)胞生化過(guò)程如代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳遞、細(xì)胞周期，同系保守的子通路以及關(guān)于化學(xué)物質(zhì)、酶分子、酶反應(yīng)等信息。KEGG提供的整合代謝途徑查詢十分出色，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機(jī)物的生物降解，不僅提供了所有可能的代謝途徑，而且對(duì)催化各步反應(yīng)的酶進(jìn)行了全面的注解。KEGG是進(jìn)行生物體內(nèi)代謝分析、代謝網(wǎng)絡(luò)研究的強(qiáng)有力工具［23］。使用KEGG對(duì)干旱脅迫下2種苜蓿的EST進(jìn)行了分析，KEGG將其分成13個(gè)代謝過(guò)程（圖2）。

圖2 黃花苜蓿和蒺藜苜蓿EST序列的KEGG分類Fig.2 KEGG category of ESTs from M.falcata and M.truncatula libraries

2.3 ERN 1和Mf CAS30／MtCAS31干旱脅迫下的表達(dá)

黃花苜蓿和蒺藜苜蓿具有很近的親緣關(guān)系，兩者之間的基因具有很高的相似性［24］?；诖它c(diǎn)，分析了2種苜蓿同源基因在干旱脅迫下的表達(dá)差異。

ERN1是ERF家族的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)分析其在2種苜蓿中的表達(dá)（圖3），表明隨著干旱脅迫程度的增加該基因在黃花苜蓿中的表達(dá)量逐漸增加，而在蒺藜苜蓿中干旱響應(yīng)上調(diào)后第6天表達(dá)量開(kāi)始下降。

黃花苜蓿的Mf CAS30和蒺藜苜蓿的MtCAS31均在各自的差減文庫(kù)中被發(fā)現(xiàn)，半定量試驗(yàn)表明Mf CAS30和MtCAS31均受干旱誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但是Mf CAS30響應(yīng)干旱比MtCAS31早，并且表達(dá)量高（圖3）。

圖3 ERN1和MfCAS30／MtCAS31在干旱脅迫下的表達(dá)水平Fig.3 The expression level of ERN1 and MfCAS30／MtCAS31 under drought stress

3 討論

3.1 差減文庫(kù)的構(gòu)建

抑制性差減雜交技術(shù)已廣泛應(yīng)用于篩選抗性基因的研究中，例如干旱［20，21］，低溫［25］，鹽［26］，高溫［19］以及低磷［27］等。但是這些研究都是就1個(gè)物種進(jìn)行差減文庫(kù)的構(gòu)建，而本研究平行構(gòu)建黃花苜蓿和蒺藜苜蓿2個(gè)干旱相關(guān)的差減文庫(kù)，不僅得到了各自干旱響應(yīng)的基因，而且還可以通過(guò)2個(gè)文庫(kù)的比較發(fā)現(xiàn)更加抵抗干旱脅迫的黃花苜蓿中的特異基因。

3.2 差異基因的分析

通過(guò)比較黃花苜蓿和蒺藜苜蓿EST的GO分類，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞定位大類中的胞外區(qū)（extracellular region）和膜／內(nèi)膜（membrane／enclosed lumen）是黃花苜蓿所特有的，這些基因編碼的是細(xì)胞的組成部分，可能在干旱脅迫下對(duì)于穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)起到了重要作用。在分子功能大類中黃花苜蓿的抗氧化活性（0.36%／0.17%）、分子傳導(dǎo)活性（0.36%／0.17%）和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性（1.28%／0.71%）都比蒺藜苜蓿占的比例高，這可能有利于黃花苜蓿在干旱脅迫下感受信號(hào)，激活抗氧化系統(tǒng)，并且在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控以應(yīng)對(duì)干旱脅迫。生物功能大類中黃花苜蓿刺激響應(yīng)（1.82%／1.06%）較蒺藜苜蓿高，表明黃花苜蓿受到脅迫后更易表達(dá)相應(yīng)的基因以應(yīng)對(duì)干旱。

KEGG分析表明，干旱脅迫下黃花苜蓿的氨基酸代謝、碳水化合物代謝和能量代謝都比蒺藜苜?？焖佟｜S花苜蓿氨基酸代謝加速也許是由于脯氨酸對(duì)干旱的響應(yīng)造成的，而更加活躍的碳水化合物和能量的代謝不僅可以為黃花苜蓿在干旱脅迫下提供足夠的能量，還可以提供植物其他代謝過(guò)程所必需的底物。這些變化都有利于黃花苜?？梢栽谶m度干旱的情況下保持正常的生長(zhǎng)狀態(tài)。

ERF家族基因在植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫過(guò)程中起到重要的作用，如調(diào)節(jié)與植物生物脅迫有關(guān)的PR基因和rd29A，rd17等植物的非生物脅迫有關(guān)的基因表達(dá)［28－30］。超表達(dá)苜蓿ERF家族的WXP1基因可以增強(qiáng)植物對(duì)干旱的抗性［17］。MtERN1最早被發(fā)現(xiàn)對(duì)苜蓿根瘤的發(fā)育具有重要作用［31］，本研究發(fā)現(xiàn)該基因也響應(yīng)干旱脅迫，預(yù)測(cè)對(duì)抵抗干旱脅迫也具有一定的作用。但是2種苜蓿的表達(dá)模式不盡相同（圖3），蒺藜苜蓿在受到較輕的干旱脅迫時(shí)便已經(jīng)大量表達(dá)，黃花苜蓿此時(shí)也開(kāi)始上調(diào)表達(dá)，但是上調(diào)倍數(shù)較蒺藜苜蓿小，可能是因?yàn)檩疝架俎?duì)干旱脅迫更加敏感。隨著干旱的加劇，黃花苜蓿該基因表達(dá)量不斷上調(diào)，而蒺藜苜蓿卻出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。黃花苜蓿該基因在較強(qiáng)干旱脅迫的條件下仍能保持較高的表達(dá)量，這可能有助于增強(qiáng)其對(duì)干旱的抵抗能力。

脫水素屬于胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的DII家族，在植物中普遍存在，其表達(dá)受到干旱、低溫、鹽和外源ABA等的誘導(dǎo)［32］。黃花苜蓿中的Mf CAS30和蒺藜苜蓿中的MtCAS31是一對(duì)同源脫水素蛋白，最早發(fā)現(xiàn)受低溫誘導(dǎo)，并且Mf CAS30在黃花苜蓿中為多拷貝，而MtCAS31在蒺藜苜蓿中為單拷貝，再加之Mf CAS30上游存在多個(gè)識(shí)別低溫信號(hào)的CRT／DRE元件，使得Mf CAS30在受到低溫脅迫時(shí)能夠更快更多的表達(dá)［7］。這2個(gè)基因都能受水分脅迫的誘導(dǎo)而大量表達(dá)，而且趨勢(shì)與低溫脅迫下相似，都是Mf CAS30受脅迫誘導(dǎo)早且表達(dá)量高。已將該基因進(jìn)行擬南芥（Arabidopsisthaliana）和苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化，以進(jìn)一步研究其在非生物脅迫下的功能。

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