紫花苜蓿耐鹽性研究進展

張立全，張鳳英，哈斯阿古拉

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010021）

＊紫花苜蓿（Medicagosativa）是一種全球性栽培的豆科苜蓿屬多年生草本植物，素有“牧草之王”和“飼料皇后”的美稱［1］。然而，50～200 mmol／L NaCl脅迫就會顯著降低紫花苜蓿的產(chǎn)量［2］。因此，選育耐鹽紫花苜蓿品種既能提高鹽堿地的利用，擴大紫花苜蓿種植面積，增加其產(chǎn)量，促進畜牧業(yè)的發(fā)展，又可以改良土壤，保持水土和保護生態(tài)環(huán)境。

近年來，國內(nèi)外有關(guān)紫花苜蓿耐鹽性的研究主要集中在紫花苜蓿耐鹽品種的雜交選育、耐鹽性生理、耐鹽相關(guān)基因特性分析以及耐鹽品種的基因工程選育。筆者圍繞這幾方面對紫花苜蓿的耐鹽性研究進展進行綜述，旨在為今后的研究工作提供參考。

1 耐鹽紫花苜蓿雜交培育

20世紀，育種學(xué)家們在不完全了解作物表型和生理生化相互關(guān)系的情況下，通過傳統(tǒng)的雜交育種方法獲得了耐鹽、高產(chǎn)、高品質(zhì)和抗病的作物新品種。紫花苜蓿的耐鹽育種在國外也有報道，如通過雜交培育獲得的耐鹽品 種 AZ－Germ SaltII［3］、AZ－90NDC－ST［4］、AZ－97MEC 和 AZ－97MEC－ST［5］、ZS－9491 和 ZS9592［6］以 及 Alfalafa［7］。Peel等［8］建立了溫室中高效篩選耐鹽紫花苜蓿的方法。我國的苜蓿育種工作起步較晚［9］，但目前通過傳統(tǒng)雜交育種已獲得了9個耐鹽性品種（表1）。

2 紫花苜蓿耐鹽生理研究

2.1 耐鹽生理研究

為了選育耐鹽新品種，對紫花苜蓿耐鹽性生理的研究十分必要，而且近年來已有許多相關(guān)研究報道。Torabi等［18］分析了不同氣候條件下紫花苜蓿的耐鹽性，發(fā)現(xiàn)不同品種紫花苜蓿因基因型不同而耐鹽性不同，源于干旱荒漠地區(qū)的紫花苜蓿品種的耐鹽性強于其他地區(qū)紫花苜蓿的耐鹽性。Na2SO4和NaCl脅迫明顯影響了紫花苜蓿的生長和離子吸收，相對耐鹽性強的品系莖部Na＋、Cl－和S2－的含量相對較低，且在以Na2SO4為主要鹽分的土地上屬于中度耐鹽植物［19］。150 mmol／L NaCl長期脅迫紫花苜蓿，降低了葉片的大小，對老葉片引起的鹽損傷比新葉片的嚴重，而且這種損傷與Na＋／K＋和清除H2O2酶的活性有關(guān)［20］。隨著灌溉水中NaCl濃度（0～110 mmol／L）的升高，紫花苜蓿中Na和Cl的含量明顯增高，而高濃度的Na和Cl將會影響苜蓿的品質(zhì)，但在葉片中Ca和Mg的含量降低，在莖中K的含量增加，Zn和Fe在葉和莖中均降低，而這些微量金屬離子含量的變化尚未影響到苜蓿的品質(zhì)，仍適合動物的吸收［21］。鹽脅迫既影響抗氧化酶的活性，又引起了脯氨酸的積累［22］，鹽脅迫條件下紫花苜蓿發(fā)芽期抗氧化酶活性與其耐鹽性呈正相關(guān)［23］，耐鹽品種抗氧化酶活性高于敏鹽品種［23，24］，但紫花苜蓿苗期植株地上部Na＋／K＋與品種的耐鹽性呈負相關(guān)［25］。

表1 耐鹽紫花苜蓿品種Table 1 Cultivar of salt－tolerance alfalfa

低濃度的NaCl對紫花苜蓿種子的發(fā)芽和幼苗生長沒有抑制作用或者具有促進作用，而外施ABA可以減弱高濃度NaCl對幼苗生長的抑制作用［26，27］，用維生素C浸種處理可促進紫花苜蓿種子在鹽脅迫下的萌發(fā)，增強根系和幼苗的生長［28］，沙引發(fā)也可提高紫花苜蓿種子的活力和抗鹽脅迫能力，促進鹽逆境下種子的萌發(fā)和幼苗生長［29］。Wang等［30］研究發(fā)現(xiàn)H2S可能是通過與NO的相互作用，減少鹽脅迫對植物氧化損傷，而緩解NaCl脅迫引起紫花苜蓿種子發(fā)芽和幼苗生長的抑制作用，增強紫花苜蓿對鹽脅迫的應(yīng)答耐性。近來，研究發(fā)現(xiàn)γ－射線的照射或臭氧協(xié)同脅迫時，也可提高紫花苜蓿的耐鹽性。γ－射線照射下，紫花苜蓿中Na＋積累降低［31］；在臭氧協(xié)同脅迫時，鹽土上紫花苜蓿相對產(chǎn)量增加42%［32］。

在自然界，鹽脅迫和堿脅迫通常會同時發(fā)生，尤其在我國華北地區(qū)的土地鹽分主要是中性鹽（NaCl和Na2SO4）和堿性鹽（Na2CO3和Na HCO3），而Na2CO3和Na HCO3含量約為總鹽分的90%［33］。因此，了解混合鹽堿對紫花苜蓿的影響亦十分必要。Peng等［34］用混合鹽（NaCl、Na2SO4、Na HCO3和Na2CO3）和混合鹽堿（鹽濃度24～120 mmol／L，p H 7.03～10.32）處理紫花苜蓿，評析紫花苜蓿對混合鹽堿適應(yīng)的生理特性，發(fā)現(xiàn)高濃度的混合鹽堿的脅迫損傷強于鹽脅迫或堿脅迫。Gao等［35］分析了混合鹽堿對紫花苜蓿種子發(fā)芽的影響，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫或堿脅迫引起紫花苜蓿胚根和胚芽長度的差異，而且混合鹽堿脅迫還可以引起可溶性糖和Na＋／K＋的變化。張永峰等［36，37］分析了混合NaCl／Na2CO3脅迫對紫花苜蓿生理指標的影響，發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的增大，可溶性糖、脯氨酸含量、抗氧化酶以及束縛水和自由水比率升高，而葉片持水力降低。

紫花苜蓿與根瘤菌共生固氮的生理特性對改良土壤肥力，提高作物產(chǎn)量有著十分重要的作用和意義，但在鹽漬地鹽脅迫下豆科牧草共生固氮體系效能降低。有關(guān)紫花苜蓿耐鹽性和固氮能力的相互作用亦有研究報道。Aydi等［38］比較分析了鹽脅迫下紫花苜蓿的固氮能力和離子平衡，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫降低了紫花苜蓿的根瘤效率，但相對耐鹽的品種葉片Na＋含量最低，且根瘤量最大。Mhadhbi和Aouani［39］認為氮的固定減弱了鹽脅迫引起的氧化脅迫，而Salah等［40］提出苜蓿屬植物的固氮耐鹽作用是與結(jié)節(jié)糖代謝有關(guān)的新觀點。

環(huán)境營養(yǎng)成分會明顯的影響植物對鹽環(huán)境的適應(yīng)，鹽脅迫會抑制磷（phosphorus，P）營養(yǎng)的吸收，且在低濃度P時，這種相互影響更加嚴重。Rogers等［41］分析了NaCl和P共同作用對紫花苜蓿的耐鹽性和P吸收的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度鹽脅迫時，添加P可以促進莖的生長，但低濃度P營養(yǎng)引起的生長抑制作用比鹽脅迫更嚴重。

2.2 耐鹽篩選時期及指標研究

對于紫花苜蓿耐鹽性篩選和鑒定的時期，AI－Khatib和Collins［42］認為在早期進行耐鹽篩選最為合適，因為紫花苜蓿在發(fā)芽期和苗期對鹽分比較敏感，Li等［43］分別分析了鹽（NaCl∶Na2SO4＝1∶1，p H 7.01～7.05）和堿（Na HCO3∶Na2CO3＝1∶1，p H 9.80～10.11）對紫花苜蓿的影響，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿在發(fā)芽期和幼苗早期對鹽和堿的脅迫均很敏感，但堿脅迫引起的危害較鹽脅迫嚴重。Johnson等［44］發(fā)現(xiàn)發(fā)芽期的混合選擇能夠提高紫花苜蓿的耐鹽性。McCoy［45］則認為紫花苜蓿在苗期進行耐鹽篩選最易進行，于卓等［46］發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿苗期對鹽分反應(yīng)較發(fā)芽期更為敏感。

紫花苜蓿耐鹽性鑒定的分析指標目前仍有不同的觀點，李國良等［47］選用地上生物量作為耐鹽性鑒定指標，對適宜我國北方種植的苜蓿品種進行耐鹽性鑒定。劉春華和張文淑［48］分析了69個苜蓿品種的耐鹽性，提出葉片細胞膜透性和脯氨酸積累量不能作為耐鹽評價的指標。Wang和Han［22］認為抗氧化酶活性可以作為紫花苜蓿發(fā)芽期耐鹽性鑒定的分析指標。任衛(wèi)波等［49］提出了應(yīng)用近紅外指紋光譜（near infrared reflectance spectroscopy，NIRS）快速鑒別紫花苜蓿品種耐鹽性的新方法，并通過對20個紫花苜蓿品種進行聚類分析，建立了紫花苜蓿品種耐鹽性鑒定模型。李源等［50］提出運用標準差系數(shù)賦予權(quán)重法進行綜合評價，不但考慮了不同指標的權(quán)重，還定量的鑒定出了每份材料的耐鹽能力，比聚類分析的結(jié)果更具科學(xué)合理性。在此基礎(chǔ)上，探討了鹽脅迫下紫花苜蓿的生理反應(yīng)，認為可溶性糖含量、細胞質(zhì)膜透性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、水分飽和虧缺以及葉水勢等可直接作為耐鹽評價的鑒定指標。姜健等［51］利用隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)分析紫花苜蓿耐鹽種質(zhì)的遺傳多樣性，為紫花苜蓿耐鹽種質(zhì)核心種質(zhì)庫構(gòu)建和耐鹽新品種選育提供了理論依據(jù)。

3 紫花苜蓿耐鹽基因工程研究

3.1 紫花苜蓿耐鹽相關(guān)基因

近年來，許多參與調(diào)節(jié)離子平衡、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化酶、轉(zhuǎn)錄因子等方面的鹽誘導(dǎo)相關(guān)基因已從紫花苜蓿中獲得克隆，而且這些基因與耐鹽相關(guān)的功能特性也得到充分確認。

3.1.1 離子平衡相關(guān)基因 為了適應(yīng)鹽脅迫，植物進化獲得了一系列的適應(yīng)機制，其中之一是將Na＋區(qū)隔在葉泡中，來減少胞質(zhì)中過量Na＋引起的損傷，同時將Na＋作為有效的滲透調(diào)節(jié)劑來維持滲透平衡，從而增強植物的耐鹽性和吸水能力。植物中Na＋在葉泡中的區(qū)隔化是由Na＋／H＋反向轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的。紫花苜蓿Na＋／H＋反向轉(zhuǎn)運體基因Ms NH X1的表達受高濃度NaCl誘導(dǎo)，且MsN HX1具有轉(zhuǎn)運Na＋的功能，轉(zhuǎn)Ms NH X1擬南芥（Arabidopsisthaliana）的耐鹽性增強［52］。Na＋／H＋反向轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)Na＋在葉泡中的區(qū)隔化是由液泡 H＋－泵、H＋－ATPase和 H＋－焦磷酸酶（H＋－pyrophosphatase，H＋－PPase）產(chǎn)生 H＋梯度驅(qū)動的。Sibole等［53］分析了木本苜蓿（Medicagoarborea）質(zhì)膜H＋－ATPase在應(yīng)答鹽脅迫時的作用，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫時木本苜蓿H＋－ATPase活性增強，能夠選擇性的清除葉片中的Na＋，維持葉片的生長，因此，H＋－ATPase的活性增加可能與適應(yīng)鹽脅迫而清除Na＋有關(guān)。

3.1.2 滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因 在逆境脅迫時，脯氨酸是被公認的滲透調(diào)節(jié)劑。脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶△1－二氫毗咯－5－羧酸合成酶［Delta（1）－pyrroline－5－carboxylate synthetase］基因P5CS是目前研究比較多的滲透調(diào)節(jié)基因。Ginzberg等［54］從鹽脅迫紫花苜蓿根部cDNA文庫中分離獲得了2個編碼P5CS的c DNA，即MsP5CS－1和MsP5CS－2，二者的表達均受鹽脅迫誘導(dǎo)。為了進一步了解鹽脅迫對脯氨酸合成和降解的影響，Miller等［55］克隆了紫花苜蓿脯氨酸脫氫酶（proline dehydrogenase）基因MsPDH和△1－二氫毗咯－5－羧酸脫氫酶［Delta（1）－pyrroline－5－carboxylate dehydrogena－se］基因MsP5CDH，表達分析顯示鹽脅迫引起的脯氨酸積累和MsPDH基因的轉(zhuǎn)錄水平降低呈正相關(guān)，而鹽脅迫沒有影響基因MsP5CDH和MsP5CS的表達。Deutch和Winicov［56］從耐鹽紫花苜蓿根特異性的cDNA文庫中篩選獲得了一個cDNA，被命名為MsPRP2，編碼富含脯氨酸的細胞壁蛋白，其表達受鹽脅迫的誘導(dǎo)。

Nolan等［57］從蒺藜苜蓿中克隆獲得了脅迫激酶基因MtSK1，體外實驗顯示MtSK1的表達受鹽脅迫的誘導(dǎo)。LEA（late embryogenesis abundant）蛋白是在植物胚胎發(fā)育晚期產(chǎn)生的，約占細胞總蛋白的4%，LEA基因的表達受滲透脅迫的調(diào)節(jié)。紫花苜蓿MsLEA3－1基因的表達受NaCl和ABA的誘導(dǎo)，超表達Ms LEA3－1的轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotianabenthamiana）的耐鹽性明顯增強［58］，表明 Ms LEA3－1蛋白具有鹽脅迫保護功能，因此Ms－LEA3－1基因具有耐鹽基因工程候選基因的潛能。Jin等［59］以中苜1號為材料，利用消減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）技術(shù)構(gòu)建了紫花苜蓿鹽脅迫表達cDNA文庫，獲得了LEA蛋白基因。

3.1.3 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因 Winicov［60］首次從篩選獲得的耐鹽紫花苜蓿細胞系中克隆到了轉(zhuǎn)錄因子基因Alfin1，其編碼鋅指蛋白，可以與紫花苜蓿鹽誘導(dǎo)表達基因MsPRP2啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)MsPRP2的表達［61］。蒺藜苜蓿Krüppel類鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Mt ZPT2－1能夠提高酵母細胞的耐鹽性，表達反向MtZPT2－1基因的紫花苜蓿失去具有固氮能力的結(jié)節(jié)［62］。Merchan等［63］發(fā)現(xiàn)Mt ZPT2－1基因主要在根和根部結(jié)節(jié)表達，且受鹽脅迫的誘導(dǎo)。表達反向Mt ZPT2－1基因的紫花苜蓿恢復(fù)鹽脅迫損傷的敏感性比未轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿更強，因此Mt ZPT2－1基因可能會被作為一個有效的分子標記，應(yīng)用在紫花苜蓿耐鹽性育種的耐鹽性篩選中。紫花苜蓿Cab9基因是一個AP2蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子基因［64］。Chao等［65］從紫花苜蓿c DNA文庫中克隆獲得了紫花苜蓿鋅指蛋白基因MsZFN，其表達明顯受NaCl的誘導(dǎo)。

3.1.4 抗氧化相關(guān)基因 Kang等［64］利用SSH技術(shù)構(gòu)建了蒺藜苜蓿鹽脅迫表達cDNA文庫，獲得了35個功能已知的基因表達序列標簽（expressed sequence tags，ESTs），其中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）－1，CuZn－SOD和半胱氨酸蛋白酶基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達。Rubio等［66］分析了在結(jié)節(jié)和葉片線粒體中表達 Mn－SOD、在葉綠體中表達MnSOD和FeSOD的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的SOD活性，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿的SOD在組織器官中的活性受轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，且FeSOD具有重要的抗氧化功能。

血紅素加氧酶（haem oxygenases，HO）催化血紅素氧化降解，具有抗氧化保護的作用。紫花苜蓿HO1基因在成熟根結(jié)節(jié)大量表達，但其表達不受氧化劑H2O2、除草劑和硝酸鈉的誘導(dǎo)，表明紫花苜蓿HO1不具有抗氧化保護的作用［67］。韓毅和沈文飚［68］發(fā)現(xiàn)HO的活性誘導(dǎo)劑高鐵血紅素對汞誘導(dǎo)紫花苜蓿根部組織的氧化損傷具有保護作用，而Fu等［69］的研究發(fā)現(xiàn)在氧化劑H2O2和硝酸鈉處理時，紫花苜蓿HO2基因的表達被上調(diào)，說明HO2可能具有抗氧化保護的作用。

3.1.5 鈣相關(guān)蛋白基因 植物鈣依賴蛋白激酶（calcium－dependent protein kinases，CDPKs）參與各種信號途徑，MtCPK3基因是蒺藜苜蓿根部CDPK異構(gòu)體，其在鹽脅迫早期出現(xiàn)表達［70］。紫花苜蓿鈣相關(guān)蛋白（calmodulin－related protein）PPRG1具有傳導(dǎo)逆境脅迫信號的功能，PPRG1的表達在鹽、滲透、低溫以及ABA的脅迫下快速上調(diào)［71］。

3.1.6 其他功能相關(guān)基因 Winicov和Button［72］分析了鹽脅迫對紫花苜蓿光合作用相關(guān)基因表達的影響，結(jié)果顯示光合作用相關(guān)葉綠體基因psbD、psaB、atp B、rbc L以及核基因pCab4、p Cabl、rbcS在耐鹽紫花苜蓿中的表達增強。解旋酶在植物中參與適應(yīng)鹽和低溫的脅迫，紫花苜蓿解旋酶1基因（M.sativahelicase 1，M H1）在根、莖和葉片中均有表達，且MH1的表達受NaCl、ABA和甘露醇的誘導(dǎo)。由35S啟動子驅(qū)動在擬南芥中組成型表達M H1，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗旱性明顯增強，抗氧化能力以及參與滲透調(diào)節(jié)的脯氨酸含量均升高，表明M H1基因通過增強清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）和滲透調(diào)節(jié)的能力來增強耐鹽和抗干旱的能力［73］。在真核生物模式植物煙草中表達紫花苜蓿線粒體熱激蛋白（heat shock protein）基因Ms HSP23，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯高于對照植株［74］。

3.2 耐鹽紫花苜?；蚬こ膛嘤?/h3>

1985年，Vasil在國際草原學(xué)大會上第一次報告了利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將特定基因?qū)肽敛莸目尚行?，為基因工程技術(shù)改良牧草，增加牧草對逆境的適應(yīng)能力奠定了理論基礎(chǔ)。1986年，Deak等［75］首次報道利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗性苜蓿植株。此后，利用基因工程技術(shù)提高苜?？鼓嫘砸殉蔀檐俎ＳN的重要途徑。目前，已有許多利用轉(zhuǎn)耐鹽相關(guān)基因來改良紫花苜蓿耐鹽性的研究報道［76，77］。

鹽脅迫時，在蒺藜苜蓿中表達綠藻（Anabaenavariabilis）黃素氧還蛋白基因flavodoxin，可引起轉(zhuǎn)基因植株結(jié)節(jié)正調(diào)控固氮作用的氧化還原平衡酶活性變化，使得轉(zhuǎn)基因植株的固氮能力與對照植株之間存在顯著差異［78］。因此，flavodoxin基因具有改善豆科牧草耐鹽和固氮特性的潛能。Verdoy等［77］在蒺藜苜蓿中表達P5CS基因，首次獲得了通過增強耐鹽性而提高固氮能力的轉(zhuǎn)基因苜蓿。Suárez等［79］將酵母海藻糖－6－磷酸合成酶（trehalose－6－phosphate synthase，TPS）基因TPS1和海藻糖－6－磷酸磷酸酶（trehalose－6－phosphate phosphatase，TPP）基因TPS2融合，分別由35S和rd29A啟動子驅(qū)動在紫花苜蓿中表達，轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性顯著增強，這是首次將海藻糖代謝基因應(yīng)用于紫花苜?；蚬こ讨校姨岣吡俗匣ㄜ俎δ婢趁{迫的保護能力。

Li等［80］在紫花苜蓿中高效表達鹽生植物蘇打豬毛菜（Salsolasoda）Na＋／H＋反向轉(zhuǎn)運體基因SsN HX1，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性顯著增強，可以在400 mmol／L NaCl脅迫條件下生長50 d。Jin等［81］在紫花苜蓿中誘導(dǎo)表達了Gm DREB1基因，Nothern雜交表明轉(zhuǎn)基因植株的P5CS基因表達被上調(diào)，且轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的耐鹽性比對照植株顯著提高。Bao等［76］將擬南芥H＋－PPase基因AVP1導(dǎo)入紫花苜蓿新疆大葉苜蓿中，分析超表達AVP1的轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)AVP1可以明顯地提高紫花苜蓿的耐鹽性。Winicov和Bastola［82］將轉(zhuǎn)錄因子Aflin1導(dǎo)入紫花苜蓿，超表達Aflin1的愈傷組織可抵抗171 mmol／L NaCl脅迫作用，同時增強了MsPRP2的表達，且轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的耐鹽性增強［83］。劉艷芝等［84］將酵母HAL1基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿龍牧803，獲得了11株在含0.6%～1.0%NaCl的MS培養(yǎng)基上正常生長的轉(zhuǎn)基因植株。王瑛等［85］將大麥（Hordeumvulgare）lea3基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中苜1號，與對照植株相比，轉(zhuǎn)基因苜蓿耐鹽性顯著增強?；療睿?6］將東北野生大豆（Glycinesoja）S－硫腺苷甲硫氨酸合成酶（S－Adenosy－L－Methion－nine，SAMS）基因GsSAMS導(dǎo)入肇東苜蓿，培育出耐鹽堿的轉(zhuǎn)基因苜蓿新株（品）系。王玉祥等［87，88］分析了表達費氏中華根瘤菌（Sinorhizobiumfredii）糖基／苷轉(zhuǎn)移酶基因rst B保定苜蓿轉(zhuǎn)基因幼苗的耐鹽性，鹽脅迫對幼苗的發(fā)芽率和根系影響的結(jié)果顯示rst B基因可以顯著提高紫花苜蓿的耐鹽性，而且轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素和甜菜堿的含量呈增長趨勢，而細胞膜相對透性呈下降趨勢，表明轉(zhuǎn)基因植株通過這些生理機制變化適應(yīng)鹽脅迫，減輕鹽損傷，使其耐鹽性優(yōu)于對照植株。

山東省林業(yè)科學(xué)研究院課題組采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將山菠菜（Atriplexhortensis）甜菜堿醛脫氫酶基因Ah－BADH導(dǎo)入紫花苜蓿受體材料中苜1號中，獲得了PCR陽性植株。耐鹽實驗結(jié)果表明，T1代轉(zhuǎn)基因植株可耐受0.8%和0.9%NaCl的脅迫，并正常生長，且BADH基因在T2代轉(zhuǎn)基因植株中符合孟德爾分離法則，耐鹽性明顯高于未轉(zhuǎn)基因受體植株，經(jīng)過對T3代轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性鑒定和遺傳分離篩選，通過自交和雜交選育出遺傳穩(wěn)定、綜合性狀優(yōu)良且耐鹽堿強的轉(zhuǎn)基因苜蓿新品種山苜2號［89－92］。Liu等［93］將Ah BADH導(dǎo)入紫花苜蓿Sanditi品種中，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯增強。

張立全等［94，95］利用花粉管通道法將鹽生植物紅樹總DNA導(dǎo)入紫花苜蓿阿爾崗金品種，獲得12株耐鹽性強的T0代植株。RAPD分析初步證實外源DNA已經(jīng)整合到受體的基因組中，而且T0代植株耐鹽能力提高可能與外源基因的導(dǎo)入有關(guān)。T1代幼苗經(jīng)300 mmol／L NaCl脅迫后測定耐鹽相關(guān)生理生化指標，結(jié)果表明T1代植株耐鹽性明顯增強，并獲得了T1代耐鹽株系，為進一步培育耐鹽品種提供了新的種質(zhì)資源。

4 結(jié)束語

紫花苜蓿作為重要的優(yōu)良豆科牧草，對畜牧業(yè)的發(fā)展以及生態(tài)環(huán)境的改善起著重要作用，但中度耐鹽的能力限制了紫花苜蓿的種植范圍，因此選育耐鹽性強的紫花苜蓿新品種是育種學(xué)家們急需解決的問題。育種學(xué)家們選用傳統(tǒng)的雜交育種或基因工程技術(shù)進行了大量的新品種選育工作，雖然利用傳統(tǒng)雜交技術(shù)已經(jīng)獲得了許多耐鹽品種，但由于選育周期性長、費時耗力等缺點限制了傳統(tǒng)雜交育種的發(fā)展和利用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程技術(shù)便成為全世界育種學(xué)家們熱衷的育種方法［96，97］。目前，大量的研究報道利用基因工程技術(shù)已獲得了耐鹽性紫花苜蓿新品系（種），但除山苜2號品種外，其他的研究報道結(jié)果仍是基于人工模擬的環(huán)境——實驗室或溫室中的NaCl脅迫的研究特性，缺少相應(yīng)的品種區(qū)域特性試驗研究，而區(qū)域試驗是評價新品種適應(yīng)性最直接可靠的辦法［98］。另外，由于植物的耐鹽性是一個受多基因控制的數(shù)量性狀［99，100］，而目前的研究報道只涉及單基因的轉(zhuǎn)化，這可能是限制基因工程耐鹽育種發(fā)展的原因之一。再者，目前的研究報道均是在轉(zhuǎn)基因品系（種）的生長早期——發(fā)芽期和（或）幼苗期進行的耐鹽性評析，而其耐鹽性是否可以維持并穩(wěn)定遺傳尚有待證實，且某個發(fā)育階段的耐鹽性尚不能代表植物的耐鹽性［101］。

基因工程技術(shù)育種過程中選擇標記基因的使用引起了人們對生物安全的顧慮，F(xiàn)erradini等［102］分析了無篩選標記轉(zhuǎn)化（marker－less transformation）和共轉(zhuǎn)化（co－transformation）方法獲得無選擇標記基因（marker－free）紫花苜蓿的效率，發(fā)現(xiàn)這2種方法雖然能獲得無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿，但轉(zhuǎn)化效率非常低，在實際應(yīng)用中仍需要進一步完善。因此，目前高效的紫花苜蓿轉(zhuǎn)化中選擇標記基因仍是必需的。但是為了避免源于細菌的選擇標記基因在植物基因工程中帶來抗生素抗性的危險，F(xiàn)erradini等［103］克隆了源于紫花苜蓿的谷氨酸1－半醛轉(zhuǎn)氨酶（glutamate 1－semialdehyde aminotransferase）基因MsGSA，并對MsGSA進行單一位點突變修飾，通過轉(zhuǎn)化煙草和紫花苜蓿分析其選擇效率，開發(fā)獲得了可用于紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的高效選擇標記基因。

紫花苜蓿的耐鹽性是個較復(fù)雜的問題，它是耐鹽相關(guān)代謝途徑以及其他多種代謝途徑的協(xié)同綜合作用的結(jié)果。目前，人們對紫花苜蓿的耐鹽相關(guān)代謝途徑仍不完全清楚，這正是限制獲得耐鹽性強的新品種的主要障礙。因此，全面研究并了解紫花苜蓿的耐鹽相關(guān)代謝途徑以及耐鹽相關(guān)基因和其表達模式是紫花苜蓿耐鹽分子育種的前提條件。要獲得耐鹽性強的品種，還需要全面地研究和了解紫花苜蓿的耐鹽機制，相信在此基礎(chǔ)上，必可培育出具有實際應(yīng)用價值的耐鹽新品種，為畜牧業(yè)的發(fā)展做出貢獻。

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