苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因的表達特性和生物信息學(xué)分析

陳婷婷，楊青川，張新全，康俊梅，丁旺，張鐵軍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安625014）

＊AP2／ERF轉(zhuǎn)錄因子包含AP2結(jié)構(gòu)域，最早從擬南芥（Arabidopsisthaliana）中分離得到。AP2結(jié)構(gòu)域由高度保守的57～70個氨基酸殘基組成，包含YRG區(qū)和RAYD區(qū)，YRG區(qū)的N－端由富含20個氨基酸殘基的堿性和親水性區(qū)域組成，對識別各類順式作用元件并與之相互結(jié)合起關(guān)鍵作用；RAYD區(qū)位于AP2／ERF結(jié)構(gòu)域的C－端，約含有40個氨基酸殘基，其中約18個氨基酸殘基組成的核心區(qū)可形成雙親性的α－螺旋。DNA結(jié)合區(qū)與DNA的結(jié)合依賴于YRG區(qū)，RAYD區(qū)通過影響YRG區(qū)的構(gòu)象或與其他蛋白發(fā)生相互作用調(diào)節(jié)AP2結(jié)構(gòu)域與DNA的結(jié)合［1，2］。根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)量可以將 AP2／ERF轉(zhuǎn)錄因子分為3個家族［3］，分別為 AP2、ERF和RAV家族。AP2家族包含2個AP2結(jié)構(gòu)域，主要調(diào)控植物的生長發(fā)育；RAV家族包含1個AP2結(jié)構(gòu)域和1個B3結(jié)構(gòu)域；ERF家族蛋白只包含1個AP2結(jié)構(gòu)域，又可分為2個亞家族：CBF／DREB亞家族和ERF亞家族，CBF／DREB在植物應(yīng)答非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要作用［4－6］，ERF亞家族主要參與生物脅迫應(yīng)答［7］，許多研究表明ERF亞家族成員同時也參與非生物脅迫應(yīng)答。苜蓿（Medicagosativa）是一種優(yōu)質(zhì)的豆科牧草［8，9］，研究其乙烯應(yīng)答因子具有重要意義。本研究以擬南芥AP2結(jié)構(gòu)域為探針?biāo)阉鱊CBI的苜蓿屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，對苜蓿屬ERF蛋白進行鑒定和分析，并通過半定量RT－PCR技術(shù)對紫花苜蓿5個ERF基因的組織表達差異性和多種條件下的表達特性進行研究，以期為進一步開展苜蓿ERF蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

以擬南芥 AP2結(jié)構(gòu)域（Genbank登錄號：1GCC＿A）為探針，運用BlastP工具（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／）在NCBI的苜蓿屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行比對，獲得的氨基酸序列根據(jù)ERF蛋白的結(jié)構(gòu)特征進行篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為：只含有1個AP2結(jié)構(gòu)域，且不包含B3結(jié)構(gòu)域。剩余的氨基酸序列運用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；運用瑞士生物信息學(xué)研究所網(wǎng)站的Protscale軟件（http：／／expasy.org／tools／protscale.html）進行疏水性輪廓預(yù)測；PBIL LYON－GERLAND數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測二級結(jié)構(gòu)；SignalP 3.0軟件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）預(yù)測信號肽；ProtComp Version 9.0（http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml）軟件預(yù)測亞細胞定位情況。

1.2 植物材料和處理

紫花苜?！爸熊?號”由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草研究室保存及提供。挑選飽滿的種子播種于MS固體培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長2周的幼苗轉(zhuǎn)入分別含有200 mmol／L NaCl、15%PEG6000、60μmol／L Al2（SO4）3、50μmol／L 生長素（IAA）、100μmol／L 脫落酸（ABA）、50μmol／L 赤霉素（GA）、100 μmol／L水楊酸（SA）、40μmol／L乙烯利（Eth）和100μmol／L茉莉酸甲酯（MeJA）的1／2MS液體培養(yǎng)基中進行處理。NaCl、PEG6000和 Al2（SO4）3的處理時間分別為0，1，6，12和24 h，激素處理的時間分別為0，1和12 h，處理完成后分別提取各處理的總RNA保存?zhèn)溆茫?011年6月14日在畜牧所試驗地中挑選1株生長3年且長勢良好的苜蓿植株，分別取根、莖、葉、花蕾和花于液氮中速凍后－80℃保存，用于組織表達特異性分析。實驗于2011年6月－2011年8月進行。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法分別提取各處理的總RNA，取100 mg幼苗全株于研缽中加入液氮充分研磨，轉(zhuǎn)入1.5 m L離心管中，加入1 m L Trizol試劑（博邁德，北京），漩渦振蕩器上劇烈震蕩1 min；加入0.2 m L氯仿，劇烈震蕩30 s后置于室溫3 min，4℃，12 000 r／min離心10 min后將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，冰上放置5 min，4℃，12 000 r／min離心10 min后棄上清，用75%的酒精懸浮沉淀2次；室溫晾干沉淀，加入30 μL焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解沉淀，保存于－80℃?zhèn)溆?。提取的總RNA參照M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Takara，大連）說明書進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。

1.4 半定量RT－PCR分析

根據(jù)核苷酸序列設(shè)計半定量引物，以紫花苜蓿肌動蛋白基因（Actin）作為內(nèi)參，c DNA第一鏈為模板，對紫花苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因表達的組織特異性以及不同處理下的表達特性進行研究，所有引物序列見表1。反應(yīng)體系為：H2O 17.25μL、10×buffer 2.5μL、d NTP 2μL、上下游引物各1μL、Taq DNA 聚合酶0.25μL、模板1 μL；反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，29個循環(huán)后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后拍照并進行分析。

表1 用于乙烯應(yīng)答因子半定量RT－PCR的引物Table 1 Primers for semi－quantitative RT－PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

以擬南芥AP2結(jié)構(gòu)域為探針?biāo)阉鬈俎俚鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫，獲得的氨基酸序列根據(jù)ERF家族的結(jié)構(gòu)特征進行篩選，獲得41個與探針高度匹配且符合ERF家族結(jié)構(gòu)特征的氨基酸序列，系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明這41個氨基酸序列又可分為5組（圖1）。從每組各選取1個成員（A1：ACJ84901.1；A2：ABO93372.1；A3：ACJ85181.1；A4：ABW06102.2；A5：ACJ84446.1），對它們的二級結(jié)構(gòu)、疏水性輪廓、信號肽和亞細胞定位情況進行預(yù)測。結(jié)果表明這5個蛋白都包含大量α螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（圖2），大部分區(qū)域表現(xiàn)為親水性（圖3），都沒有信號肽，定位于細胞核中。將這5個蛋白編碼基因的紫花苜蓿同源序列命名為MsERF1、MsERF2、MsERF6、MsERF7和MsERF9。

圖1 苜蓿乙烯應(yīng)答因子的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of Medicago ethylene response factors

2.2 紫花苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因表達的組織差異性

MsERF1基因在根和葉中的表達量高于莖、花和花蕾（圖4）；MsERF2在根、葉和花中的表達量最高，莖中的表達量次之，在花蕾中的表達量最低；MsERF6在葉和花蕾中的表達高于其他組織；MsERF7在根、莖、葉和花中高表達，在花蕾中的表達量較低；MsERF9在根、莖和葉中的表達量高于花蕾，在花中沒有表達。

2.3 NaCl處理對MsERF基因表達的影響

NaCl處理1 h后，MsERF1、MsERF7和MsERF9的表達量提高（圖5），且一直保持高表達水平；MsERF6的表達量在處理1 h后明顯升高，隨著處理時間的增加，表達量呈下降趨勢，處理12 h后表達量恢復(fù)到?jīng)]有處理時的水平，處理24 h后表達量又有輕微上調(diào)；NaCl處理對MsERF2的表達沒有影響。

2.4 PEG6000對MsERF基因表達的影響

PEG6000處理條件下，隨著處理時間的增加，MsERF1的表達量呈上升趨勢（圖6），在6 h達到最高值并保持高表達；MsERF7和MsERF9的表達量呈上升趨勢，在6 h表達量最高并保持一段時間（6～12 h），隨后表達量有輕微下降；MsERF6基因的表達量隨著處理時間的增加呈上升趨勢，在6 h達到最高值后呈下降趨勢，并最終下降到?jīng)]有處理時的表達水平；MsERF2的表達不受PEG6000誘導(dǎo)。

2.5 Al2（SO4）3 處理對 MsERF 基因表達的影響

Al2（SO4）3能誘導(dǎo)這5個基因的表達，MsERF1的表達量隨著處理時間的增加而上升（圖7），在24 h達到最大值；MsERF2基因的表達呈先上升后降低的趨勢，6 h的表達量最高；MsERF6基因的表達隨著處理時間的增加而上升，在6 h達到較高水平后呈下降趨勢，而后又呈上升趨勢；MsERF7和MsERF9的表達量在12 h達到最高，然后呈下降趨勢。

2.6 激素處理對MsERF基因表達的影響

脫落酸能誘導(dǎo)MsERF1、MsERF6、MsERF7和MsERF9的表達，其中MsERF1和MsERF6呈先上升后降低的趨勢，MsERF7和MsERF9的表達在短時間處理時沒有明顯變化，在長時間處理條件下才表現(xiàn)上升趨勢，MsERF2的表達不受脫落酸誘導(dǎo)（圖8）；生長素處理條件下，MsERF6的表達量先上升后降低，其他基因的表達量都沒有發(fā)生變化；茉莉酸甲酯處理條件下，MsERF1、MsERF6、MsERF7和MsERF9的表達量先上升后降低，而MsERF2的表達量呈一直上升的趨勢；水楊酸處理條件下，MsERF1的表達量在短時間沒有變化，在12 h表達量呈上升趨勢，MsERF2和MsERF7的表達呈先上升后下降的趨勢，MsERF6和MsERF9的表達量在短時間就表現(xiàn)上升趨勢，且一直維持在高表達水平；赤霉素處理條件下，MsERF1的表達量一直上升，MsERF2和MsERF6的表達量先上升后下降；MsERF7和MsERF9的表達量在處理1h后有明顯上升，且隨著處理時間的增加，其表達一直維持在高水平；乙烯利處理條件下，MsERF1的表達隨著處理時間的增加呈一直上升的趨勢，MsERF2和MsERF9在短時間處理時表達量有顯著上升，然后維持在高水平；MsERF6和MsERF7的表達在短時間沒有明顯變化，處理12 h后，表達量上升。

3 討論

在長期的進化過程中，植物逐漸形成由功能蛋白和轉(zhuǎn)錄因子組成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以適應(yīng)環(huán)境的變化。內(nèi)外環(huán)境被植物感知后轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N信號，通過一系列的信號傳導(dǎo)，引起相關(guān)基因表達的改變，最終作出適應(yīng)性反應(yīng)。通常情況下，基因表達的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，轉(zhuǎn)錄因子通過與順勢作用元件結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達。乙烯是五大類植物激素之一，與植物的生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答有密切關(guān)系，參與植物種子萌發(fā)、果實成熟、根生長、花器官形成、葉和花的衰老等植物發(fā)育過程的調(diào)控，并調(diào)控植物應(yīng)答病害侵染和非生物脅迫等過程。通過對模式植物擬南芥的研究表明，植物體內(nèi)乙烯信號傳導(dǎo)途徑為：外界信號→ETR→CTR→EIN2→EIN3→ERF→生理生化反應(yīng)［10－12］，乙烯應(yīng)答因子在整個乙烯信號通路中占據(jù)關(guān)鍵位置。

圖4 MsERF基因表達的組織差異性Fig.4 Expression analysis of MsERF genes in different tissues

圖5 NaCl處理下MsERF基因的表達量變化Fig.5 Expression of MsERF genes under NaCl treatment

轉(zhuǎn)錄因子在高等植物的生長發(fā)育及其對外界環(huán)境的反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用［13］。乙烯應(yīng)答因子是AP2／ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，只包含1個AP2結(jié)構(gòu)域且不包含B3結(jié)構(gòu)域。本研究以擬南芥AP2結(jié)構(gòu)域為探針，運用BlastP工具在NCBI的苜蓿屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行比對，獲得的氨基酸序列剔除AP2家族和RAV家族成員，剩余的序列符合ERF家族的結(jié)構(gòu)特征，即為苜蓿ERF家族成員。同大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子基因一樣，ERF基因的表達受到復(fù)雜的調(diào)控。大多數(shù)ERF基因都是誘導(dǎo)表達的，干旱、低溫、鹽堿、乙烯、脫落酸、病害、赤霉素、水楊酸等能誘導(dǎo)其表達，但是不同的ERF基因有不同的誘導(dǎo)表達模式，即使是同源性很高，同一條件下它們的表達模式也會有很大的不同。在已發(fā)現(xiàn)的同源性較高的ERF轉(zhuǎn)錄因子ORCAs中，ORCA2［14］和ORCA3［15］的表達受茉莉素誘導(dǎo)，調(diào)控啟動子含有茉莉素應(yīng)答元件基因的表達，而ORCA1則不受茉莉素的誘導(dǎo)，本研究中的5個ERF基因在同一條件下的表達模式有差異，這與以前的研究結(jié)果吻合。

圖7 Al2（SO4）3處理下MsERF基因的表達量變化Fig.7 Expression of MsERF genes under Al2（SO4）3 treatment

圖8 激素處理下MsERF基因的表達量變化Fig.8 Expression of MsERF genes under hormone treatments

植物感知各種外界信號，形成不同的信號傳導(dǎo)途徑，各種不同的信號傳導(dǎo)途徑可以形成交互作用［16，17］。由于交互作用的存在，植物在受到不同傷害時，往往會表現(xiàn)出同樣的適應(yīng)性反應(yīng)，交互作用是通過多個基因之間形成的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)的。作為植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，乙烯應(yīng)答因子在植物體內(nèi)多種信號通路中起著調(diào)控下游基因表達的功能，與植物的多種生理生化反應(yīng)都有密切關(guān)系。已有的研究表明，ERF基因參與植物的抗病反應(yīng)和生長發(fā)育，以及對非生物脅迫的應(yīng)答［18，19］。本研究結(jié)果表明同一個ERF基因同時受2種或多種條件的誘導(dǎo)，表明這些乙烯應(yīng)答因子可能在植物體內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑的交互作用中發(fā)揮作用。

以前的研究表明ERF基因主要參與生物脅迫的應(yīng)答，也有研究表明它們參與非生物脅迫應(yīng)答。在擬南芥中超表達Br ERF4基因可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽性和抗旱性［20］；在水稻（Oryzasativa）中超表達JERF3基因可以提高WCOR413－like，OsEnol和OsSPDS2基因的表達，使轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性和抗?jié)B透脅迫能力提高［21］；在水稻中超表達JERF1可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性［22］。本研究結(jié)果表明MsERF2基因的表達不受NaCl和PEG6000處理的影響，表明它可能不參與植物對滲透脅迫和Na／Cl離子毒害的應(yīng)答，而其表達受Al2（SO4）3的誘導(dǎo)，表明它參與鋁鹽毒害的信號傳導(dǎo)途徑；脫落酸被稱為“脅迫酸”，植物存在依賴脫落酸和不依賴脫落酸的脅迫應(yīng)答機制，MsERF2的表達不受ABA的誘導(dǎo)，表明它屬于非ABA依賴型，其余4個基因都能被NaCl、PEG6000、Al2（SO4）3和ABA誘導(dǎo)，表明它們的脅迫應(yīng)答都屬于依賴ABA型；MeJA、SA、GA和Eth與植物的抗病蟲性，5個基因的表達都能被這4種激素誘導(dǎo)，由此可以推測它們極有可能與苜蓿的抗病蟲性相關(guān)；生長素處理時只有MsERF6基因的表達受輕微影響，其余基因的表達量都沒有變化，據(jù)此推測它們都不參與到與IAA應(yīng)答的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。本研究通過半定量RT－PCR的方法對5個紫花苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因的組織表達差異性及各種處理條件下的表達模式進行分析，對進一步開展這些基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為研究植物體內(nèi)的信號傳導(dǎo)和不同信號傳導(dǎo)途徑的交互作用提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究以AP2結(jié)構(gòu)域為探針?biāo)阉鱊CBI的苜蓿蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)乙烯應(yīng)答因子的結(jié)構(gòu)特征對獲得的蛋白序列進行鑒定。系統(tǒng)進化分析表明苜蓿乙烯應(yīng)答因子可以分為5組，從每組中選取1個成員進行二級結(jié)構(gòu)、疏水性輪廓、信號肽和亞細胞定位情況分析，結(jié)果表明這5個蛋白都包含大量α螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，大部分區(qū)域表現(xiàn)為親水性，定位于細胞核中，都沒有信號肽；運用半定量RT－PCR技術(shù)研究5個紫花苜蓿乙烯應(yīng)答因子基因（MsERF1，MsERF2，MsERF6，MsERF7，MsERF9）表達的組織差異性以及各種處理條件下的表達特性。結(jié)果表明，5個乙烯應(yīng)答因子基因在葉中的表達量都明顯高于其他組織，不同基因有不同的組織表達特性；NaCl和PEG6000對MsERF2的表達沒有影響，但Al2（SO4）3能誘導(dǎo)其表達，其余基因的表達都受這3種處理的誘導(dǎo)；脫落酸對MsERF2的表達沒有影響，能夠誘導(dǎo)其他基因的表達；生長素只能影響MsERF6的表達，對其他基因的表達沒有影響；赤霉素、茉莉酸甲酯和乙烯利對5個基因的表達都起促進作用。本研究為進一步研究苜蓿蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，同時為研究不同信號傳導(dǎo)途徑之間的交互作用提供了依據(jù)。

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