新型雙香豆素類化合物通過Nrf 2/ARE通路誘導(dǎo)OGD神經(jīng)元保護研究*

王 鈞 ，張浩萌，張文彤 ，樊朝陽，李 俠△

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西安 710032)；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安 710038)；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥理系(西安710032)

腦卒中是我國第一位死因，腦缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury, I/R)是卒中后腦損傷的重要因素，而氧化應(yīng)激(Oxidative stress, OS)是I/R的關(guān)鍵機制[1]。核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf 2)控制多種抗氧化反應(yīng)原件(Antioxidant response element, ARE)，在內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中扮演關(guān)鍵角色，并通過與ARE的相互作用調(diào)控I/R中的氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而決定損傷細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸[2-3]。

雙香豆素類化合物在臨床上應(yīng)用廣泛，該類化合物可有效改善神經(jīng)系統(tǒng)微循環(huán)、清除自由基、減輕有害物質(zhì)聚集，進(jìn)一步保護神經(jīng)細(xì)胞[4-5]。我們前期研究合成了新型雙香豆素類化合物3-CF3-4-CL，初步發(fā)現(xiàn)其具有增強神經(jīng)細(xì)胞抗氧化酶活性，清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物的作用。本研究中，擬建立神經(jīng)元氧糖剝奪(Oxygen glucose deprivation， OGD)模型，以模擬動物水平I/R損傷，檢測新型雙香豆素類化合物3-CF3-4-CL對神經(jīng)元生存率、抗氧化酶的mRNA表達(dá)、抗氧化酶活性和蛋白水平的影響，明確該藥物對OGD損傷神經(jīng)元的作用和機制，為發(fā)現(xiàn)I/R新機制和新型防治方法提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實驗動物 無特定病原體(Specific pathogen free, SPF)級別健康C57BL/6孕鼠，孕14d；由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

2 受試藥物 3,3′-(3-三氟甲基-4-氯苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素(3-CF3-4-CL)。紅外光譜、核磁共振氫譜、高分辨質(zhì)譜等手段對該新型香豆素類化合物進(jìn)行分子量、結(jié)構(gòu)和純度鑒定，結(jié)果提示化合物的m/z值與化合物元素組成質(zhì)量數(shù)計算值一致，純度達(dá)99 %以上。

3 皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 大腦皮層神經(jīng)元取自14d齡的C57BL/6胎鼠，顯微操作取胎鼠腦組織，剔除腦膜和微血管，小心分離皮質(zhì)，剪碎，0.25 %胰酶消化15 min，后接種于經(jīng)多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)包被內(nèi)含10 %胎牛血清的杜爾伯科改良伊格爾(Dulbecco's modified eagle medium , DMEM)培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度約2500/mm2。次日換含2 % B 27的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后每3天半量換液，繼續(xù)37 ℃、5 %CO2+ 95 %O2條件培養(yǎng)。

6 q-PCR 用Trizol法提取神經(jīng)元總RNA，試劑盒逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；所得cDNA 以焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate，DEPC)水3倍稀釋，用于實時定量熒光PCR反應(yīng)；并使用β-actin作內(nèi)在參照基因；得到ΔCT值用來比較給藥前后mRNA相對表達(dá)量的變化。所用PCR反應(yīng)設(shè)4個復(fù)孔。Nrf 2引物序列為上游CTTTAGTCAGCGACAGAAGGAC；下游AGGCATCTTGTTTGGGAATGTG；擴增長度：227。血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)的引物序列為上游AGGTACACATCCAAGCCGAGA;下游CATCACCAGCTTAAAGCCTTCT；擴增長度：86。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)的引物序列為上游GGTGGGCCAAAGGATGAAGAG；下游：CCACAAGCCAAACGACTTCC；擴增長度：227。另一抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)的引物序列為上游：CAGTCGGTGTATGCCTTCTCG；下游：GAGGGACGCCACATTCTCG；擴增長度為：105。β-actin引物序列上游：GTGACGTTGACATCCGTAAAGA；下游：GCCGGACTCATCGTACTCC；擴增長度為245。

8 Western blot 總蛋白用蛋白裂解液提取，核蛋白、漿蛋白按試劑盒步驟提取。各組蛋白上樣量經(jīng)蛋白定量后分別上樣。經(jīng)過12 %十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠 (Sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel， SDS- PAGE) 電泳分離，濕法轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)后將聚偏氟乙烯 (Polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜放入5 %脫脂牛奶室溫封閉2 h，使用Nrf 2抗體(1∶500)、HO-1抗體(1∶500)、β-actin抗體(1∶1000)和Histone H3抗體(1∶1000),4 ℃孵育過夜，后加入適當(dāng)比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，洗膜緩沖液(Tris buffered saline tween，TBST)漂洗膜3次，每次10 min，加入電化學(xué)發(fā)光(Electro chemi luminescence, ECL)液，發(fā)光成像。Quantity One軟件進(jìn)行光密度分析。目的蛋白的相對表達(dá)量為目的條帶與對應(yīng)內(nèi)參β-actin(或Histone H3)的光密度比值。

1 神經(jīng)元形態(tài)變化 原代神經(jīng)元在接種于細(xì)胞培養(yǎng)板后，第1天觀察到細(xì)胞穩(wěn)定貼壁，并有突觸形成；第3天神經(jīng)元突觸增多、延長，胞體均勻，胞質(zhì)飽滿；第5天，神經(jīng)元突起增多并延伸，相互交織成網(wǎng)狀，初步形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)；第7天，神經(jīng)元發(fā)育成熟，突觸交互成網(wǎng)明顯，最接近其體內(nèi)狀態(tài)，可用于后續(xù)研究。

2 細(xì)胞穩(wěn)定性和細(xì)胞存活率 細(xì)胞穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，與CTRL組相比，3-CF3-4-CL藥物濃度小于50 μg/ml時對神經(jīng)元無毒性作用(P<0.05)。在細(xì)胞存活率實驗中，結(jié)果表明在3-CF3-4-CL藥物濃度逐漸提升后，3-CF3-4-CL表現(xiàn)出對OGD損傷神經(jīng)元的保護性作用，并在20 μg/ml處保護性效果最佳(P<0.05)。證明3-CF3-4-CL藥物在其無毒性濃度區(qū)間內(nèi)，表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用，并在20 μg/ml濃度下保護性效果最佳，故以20 μg/ml作為后續(xù)實驗藥物濃度(圖1)。

物料成本是產(chǎn)品開發(fā)成本的重要組成部分，物料采購協(xié)同，是影響服裝產(chǎn)品開發(fā)效率的難題。通過PDM系統(tǒng)的實施，采購人員可以通過拍攝物料照片、輸入物料參數(shù)并上傳系統(tǒng)，實現(xiàn)多部門協(xié)同共享物料數(shù)據(jù)；倉管部門可以根據(jù)設(shè)計部門的進(jìn)程與指令及時調(diào)整樣衣物料的倉儲狀況；PDM系統(tǒng)內(nèi)完成入庫信息采集、領(lǐng)用申請與出庫管理。通過系統(tǒng)集成全面開展物料管理，可以有效避免物料供應(yīng)延后、計劃外采購和重復(fù)采購等問題。

5 CCK-8檢測細(xì)胞穩(wěn)定性及存活率 神經(jīng)元以2500/mm2的密度接種于96孔板，每孔加培養(yǎng)液100 μl，生長至7d。細(xì)胞穩(wěn)定性實驗：取正常培養(yǎng)神經(jīng)元，以3-CF3-4-CL終質(zhì)量濃度為0、1、2.5、5、10、20、50、100 μg/ml的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，后加入含10%細(xì)胞增殖試劑盒-8(CCK-8)溶液的Neurobasal培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h。細(xì)胞存活率實驗：OGD組進(jìn)行OGD損傷6 h后，常規(guī)培養(yǎng)18 h；3-CF3-4-CL處理組OGD損傷6 h后，加入含3-CF3-4-CL 0、1、2.5、5、10、20、30、40、50 μg/ml培養(yǎng)液培養(yǎng)18 h；Control組未行OGD損傷，后各組均加入含10 %CCK-8溶液的Neurobasal培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h。每個濃度設(shè)置4個復(fù)孔，在450 nm處測定其吸光度。

烏蘭察布市地處內(nèi)蒙古自治區(qū)中部，2009年被國家食品藥品監(jiān)督管理局確定為“全國十個地級食品安全示范市”之一；2013年被中國城市競爭力研究會評為“中國十佳食品安全城市”；2014～2015年連續(xù)兩年被自治區(qū)食品安全委員會評為“食品藥品安全工作優(yōu)秀盟市”；2016年，被國務(wù)院食品安全委員會列為全國創(chuàng)建食品安全城市試點地區(qū)。

3 mRNA水平變化 q-PCR結(jié)果表明，與Control組相比神經(jīng)元內(nèi)Nrf 2、HO1 mRNA相對表達(dá)水平在OGD損傷后升高，在3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理組其mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P<0.05)；神經(jīng)元抗氧化酶SOD、GSH-Px的mRNA相對表達(dá)水平在OGD處理后有所下降，而在3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理組神經(jīng)元抗氧化酶SOD、GSH-Px的mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05，圖2)。

觀察組30例患者給予阿司匹林與氯吡格雷聯(lián)合治療，阿司匹林治療方法同對照組一致，同時給予患者氯吡格雷片（樂普藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H20123115）口服，75 mg/次，1次/d，連續(xù)治療30 d。

7 氧化指標(biāo)檢測 原代神經(jīng)元生長至7d，收集細(xì)胞，低溫高速離心，取上清液，分別檢測SOD、丙二醛(Malonaldehyde, MDA)、GSH-Px水平。

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理,其中計數(shù)資料用n(%)表示,采用χ2檢驗,計量資料用(±s)表示,采用t檢驗,等級資料采用秩和檢驗,若P<0.05,則表明患者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

4 OGD模型及給藥方式 取生長至7d的原代皮層神經(jīng)元，將培養(yǎng)基換為Earle's平衡鹽(Earle's balanced salt solution, EBSS)培養(yǎng)基，在含95% N2和5% CO2的缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，后將細(xì)胞取出缺氧箱，常規(guī)培養(yǎng)18 h用于后續(xù)實驗。3-CF3-4-CL溶解于0.1 %二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)，以適當(dāng)濃度稀釋于Neurobasal培養(yǎng)基。

求助渠道暢通V4（78.7）中的二級指標(biāo)面對面求助渠道暢通V41（77.9）、在線求助渠道暢通V42（78.4）分值均較低。在“以學(xué)生為中心”的課堂教學(xué)常態(tài)下，引導(dǎo)學(xué)生學(xué)會自學(xué)非常重要，但是由于學(xué)生的認(rèn)知差異性，若在自學(xué)的過程中碰到的困惑無法及時得到解答，將極大地降低其自學(xué)的自信心和能動性，所以教師為其建立暢通的求助渠道是非常重要的。當(dāng)前，該任課教師此項得分最低，需進(jìn)行求助渠道的快速完善。如建立該門課程的微信群、QQ群等線上交流平臺，建立學(xué)生互助獎勵機制，分組時盡量考慮同寢室的一組，以便線下互助。

鑒于此，為有效提高建筑業(yè)創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展績效促進(jìn)行業(yè)可持續(xù)發(fā)展，根據(jù)以上結(jié)論提出如下建議。首先是減少政府行政干預(yù)，降低政府主導(dǎo)的輸入型TFP增長。其次是讓市場在建筑業(yè)創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展中發(fā)揮決定性作用，增強市場主導(dǎo)的持續(xù)地內(nèi)生型TFP增長。最后是以“放管服”改革等為抓手更好的發(fā)揮政府的作用，有效提高科技進(jìn)步貢獻(xiàn)率，促使建筑業(yè)創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展新動能進(jìn)一步發(fā)展。

A：3-CF3-4-CL神經(jīng)元細(xì)胞穩(wěn)定性實驗,與Control組比較(CTRL), aP<0.05；B：3-CF3-4-CL對神經(jīng)元的保護性作用,與OGD (group 0) 組比較,aP<0.05

圖13-CF3-4-CL對神經(jīng)元的穩(wěn)定性和保護性作用

A：Nrf 2；B:HO-1；C:SOD；D:GSH-Px。與Control組比較,a P<0.05；與OGD組比較,b P<0.05

4 氧化和抗氧化指標(biāo) OGD組與Control組相比較，抗氧化酶SOD與GSH-Px表達(dá)量下降，MDA表達(dá)量增加(P<0.05)。3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理組與OGD組比較，抗氧化酶SOD和GSH-Px活性升高，MDA表達(dá)量降低(P<0.05，圖3)。

5 蛋白水平變化 Western blot顯示，神經(jīng)元中Nrf 2總白表達(dá)量在OGD損傷后與Control組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理組Nrf 2總蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。HO-1蛋白水平在OGD后表達(dá)量升高，3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理后其表達(dá)量進(jìn)一步升高(P<0.05)。細(xì)胞漿Nrf 2蛋白表達(dá)量在OGD組下降，在3-CF3-4-CL處理組進(jìn)一步下降(P<0.05)，細(xì)胞核Nrf 2蛋白表達(dá)量與之相反，在OGD組升高，3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理組進(jìn)一步升高(P<0.05，圖4)。

A:MDA含量變化; B:SOD含量變化; C:GSH-Px含量變化。與Control組比較，a P<0.05;與OGD組比較，b P<0.05

上：免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)；下: 蛋白條帶灰度分析。A：Nrf 2；B：HO-1；C：Cytoplasm Nrf 2；D：Nuclear Nrf 2。與Control組比較,aP<0.05;與OGD組比較,bP<0.05

圖43-CF3-4-CL對神經(jīng)元Nrf 2、HO1蛋白表達(dá)和Nrf 2核轉(zhuǎn)錄的影響

討 論

本研究通過C57BL/6小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)，利用其培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定可靠、給藥方式精準(zhǔn)、效果直接的特點，來研究腦缺血再灌注損傷在細(xì)胞水平的變化。皮層神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的結(jié)構(gòu)，改善腦缺血再灌注損傷，保護皮層神經(jīng)元是干預(yù)其預(yù)后最為關(guān)鍵的措施[6]。同時皮層神經(jīng)元也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對缺血最敏感的細(xì)胞之一，故利用神經(jīng)元糖氧剝奪模型已是目前公認(rèn)研究腦缺血再灌注損傷在體外細(xì)胞水平各種病理生理過程的最佳手段[7-8]。

雙香豆素是一種天然存在的雜環(huán)化合物，在機體擁有抗氧化、抗高血壓、抗凝血、抗癌等多種生物學(xué)活性[9]。而雙香豆素類衍生物甚多，目前已報道的雙香豆素類衍生物數(shù)量已超過2000種，也有研究報導(dǎo)部分雙香豆素類化合物擁有顯著的神經(jīng)保護性作用，故以此為基礎(chǔ)，深入研究其構(gòu)效關(guān)系，設(shè)計合成類似物，從中篩選出新型雙香豆素衍生物，開發(fā)出高效低毒的神經(jīng)保護藥物潛力巨大[10]。

Nrf 2是一種參與細(xì)胞病理生理過程的核轉(zhuǎn)錄因子，在對抗氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[11]。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激條件時，細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxy gen species，ROS)生成與降解之間的平衡被打破，胞內(nèi)RO-S過度堆積，透支了內(nèi)源性抗氧化活性物質(zhì)，從而對細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損傷性作用[12]。細(xì)胞氧化應(yīng)激條件下，Nrf 2可發(fā)生結(jié)構(gòu)變化進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞核中Nrf 2與抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合，通過一系列反應(yīng)活化Nrf 2/ARE抗氧化通路，同時在通路下游的抗氧化基因也隨之激活，如：HO-1、SOD和GSH-Px，它們都是受到Nrf 2/ARE信號通路調(diào)控的抗氧化酶，相互作用清除細(xì)胞過量產(chǎn)生的ROS，使細(xì)胞氧化還原狀態(tài)趨于平衡，緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[13]。已有相關(guān)研究表明，激活Nrf 2/ARE通路在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著神經(jīng)保護作用[14]，因此以神經(jīng)元為研究目標(biāo)，探討3-CF3-4-CL對神經(jīng)元糖氧剝奪模型的保護性作用，可為大腦缺血再灌注損傷提供一種新治療靶點和新思路。

本研究結(jié)果表明，小鼠皮層神經(jīng)元OGD損傷后，神經(jīng)元細(xì)胞穩(wěn)定性下降，在新型雙香豆素類化合物3-CF3-4-CL處理后細(xì)胞存活率增加，并在一定藥物濃度范圍內(nèi)其細(xì)胞存活率提升顯著。在3-CF3-4-CL處理后，神經(jīng)元Nrf 2、HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，其下游SOD、GSH-Px的mRNA表達(dá)也隨之增加。Nrf 2總蛋白在3-CF3-4-CL處理后表達(dá)量上調(diào)，Nrf 2漿蛋白表達(dá)量減少、核蛋白表達(dá)量增多，提示Nrf 2蛋白進(jìn)入細(xì)胞核,并與ARE相互作用啟動抗氧化調(diào)控程序。促進(jìn)下游抗氧化調(diào)控基因HO-1的表達(dá),并進(jìn)一步激活抗氧化酶，即抗氧化酶SOD與GSH-PX活化程度加強，細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力提升，清除細(xì)胞內(nèi)過度堆積的ROS,減少MDA含量,最終減輕了神經(jīng)元受到的氧化損傷，改善神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)。以上結(jié)果均提示由實驗室自主合成的新型雙香豆素類化合物3-CF3-4-CL對OGD損傷神經(jīng)元的保護作用顯著。這可為腦缺血再灌注損傷的治療提供了新干預(yù)手段與理論基礎(chǔ)。