五種動(dòng)物疫病診斷方法研究進(jìn)展

邱 楊，趙 麗，盧小雨，劉建麗，蘭文生，王 偉，陳進(jìn)會(huì)

（1.東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東東莞523072；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳518045）

根據(jù)農(nóng)業(yè)部于2008年12月11日公布的動(dòng)物疫病名錄，動(dòng)物疫病分為一、二、三類。其中一類動(dòng)物疫病具有高致病性，主要有17種，分別是口蹄疫、豬水皰病、豬瘟、非洲豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病、非洲馬瘟、牛瘟、牛傳染性胸膜肺炎、牛海綿狀腦病、癢病、藍(lán)舌病、小反芻獸疫、綿羊痘和山羊痘、高致病性禽流感、新城疫、鯉春病毒血癥和白斑綜合征。高致病性動(dòng)物疫病以傳播迅速、發(fā)病率高、病死率高等特點(diǎn)給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅和危害，甚至對(duì)人類健康與生命安全造成危害。高致病性動(dòng)物疫病給全球養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，特別是新城疫、口蹄疫、豬流感H1N1亞型、豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病等疫病頻發(fā)，給防控帶來很大的挑戰(zhàn)。

隨著我國與世界各國貿(mào)易往來不斷增加，國內(nèi)畜禽及其產(chǎn)品流通渠道增多，動(dòng)物疫病傳播途徑和機(jī)會(huì)變得更多，疫病傳播的速度變得更快。重大動(dòng)物疫病不斷發(fā)生，新的動(dòng)物疫病不斷出現(xiàn)，再加上人類生活方式的不斷改善以及動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境的變化，動(dòng)物疫病變得更加復(fù)雜和多樣化，這些使得重大動(dòng)物疫病給人類造成了更大的威脅。因此，準(zhǔn)確診斷對(duì)這些疫病的防控有重大意義。本文對(duì)5種主要高致病性動(dòng)物疫病診斷方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述。

1 臨床及病理診斷

1.1 臨床癥狀診斷

臨床癥狀診斷是通過比對(duì)患病病畜與典型征候間的相似程度所做出的初步或疑似診斷。一般為臨床檢查，系統(tǒng)檢查血、尿、糞等常規(guī)化驗(yàn)，必要時(shí)還可用其他特殊檢查方法。例如，雞感染新城疫病毒的潛伏期為2d～15d，平均7d，病雞表現(xiàn)為呼吸困難、腹瀉、排綠色糞便，采食量減少，甚至停止，精神不振，產(chǎn)蛋量下降，同時(shí)出現(xiàn)軟皮蛋、薄殼蛋、沙殼蛋和小型蛋。若臨床出現(xiàn)典型新城疫癥狀可做出疑似診斷。

1.2 病理學(xué)診斷

病理學(xué)診斷是指對(duì)多例患傳染病死亡的畜禽尸體進(jìn)行剖檢，查看其病理變化，通過對(duì)比患病病畜剖檢情況與典型剖檢情況的相似程度所做出的初步或疑似診斷；或取病料送檢，進(jìn)一步做病理組織學(xué)診斷。例如，高致病性豬藍(lán)耳病的剖檢情況為病豬胸腔、腹腔內(nèi)有大量黃色積液和纖維性滲出物，呈現(xiàn)多發(fā)性漿液纖維素性胸膜炎和腹膜炎。肺臟水腫，呈斑駁狀到褐色大理石樣病變；肺間質(zhì)增寬，間質(zhì)性肺炎病變明顯。淋巴結(jié)，特別是腹股溝淋巴結(jié)和肺門淋巴結(jié)明顯腫大。部分病死豬腎臟腫大，呈褐色或土黃色，質(zhì)地較脆，有淤血現(xiàn)象；脾臟腫大、質(zhì)脆；個(gè)別豬有消化道病變，主要表現(xiàn)為胃黏膜大面積充血，出血［1］。若剖檢情況與典型高致病性豬藍(lán)耳病剖檢情況相似，即可做出疑似診斷。

雖然臨床癥狀診斷和病理學(xué)診斷可以對(duì)患病動(dòng)物方便快速的做出初步或疑擬診斷，但在疫病的潛伏期較難準(zhǔn)確判斷，并且許多高致病性疫病存在許多類似的癥狀，如與口蹄疫有類似癥狀的疫病有水皰性口炎（VS）、豬水皰?。⊿VD）、豬水皰疹（SVE）等，不易直接做出臨床診斷，可疑病料必須借助實(shí)驗(yàn)室檢測才能進(jìn)行確診。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷方法

2.1 病原生物學(xué)診斷

病原生物學(xué)診斷技術(shù)診斷疫病的主要方法是病原微生物的分離鑒定，根據(jù)分離得到的樣本的形態(tài)或理化性質(zhì)來進(jìn)行診斷。如病毒分離鑒定是診斷口蹄疫（FMD）的最可靠的方法，主要應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物接種來分離病毒［2］。又如從待檢病料樣品中分離和培養(yǎng)豬流感病毒（SIV）在檢測宿主范圍和致病機(jī)理的研究及疫苗生產(chǎn)等方面都很重要［3］。同時(shí)也有許多報(bào)道通過病毒分離鑒定了豬流感病毒的亞型。唐續(xù)等［4］在2009年報(bào)道分離了一株豬流感病毒并鑒定其為H1N1亞型毒株。

2.2 血清學(xué)診斷

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的基本原理是將抗原或者抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，通過底物顯色后用肉眼或者分光光度計(jì)判定結(jié)果。作為一種免疫診斷技術(shù)，ELISA自20世紀(jì)70年代初問世以來發(fā)展十分迅速，已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，并且隨著技術(shù)進(jìn)步，學(xué)者們?cè)诓粩喔倪M(jìn)傳統(tǒng)ELISA的同時(shí)，還將ELISA技術(shù)與單克隆抗體（MAb）、PCR、生物素-親和素 （biotin-avidin）系統(tǒng)、Dot-blot等技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了多種新型ELISA技術(shù)［5］。孫元等［6］利用桿狀病毒表達(dá)的豬瘟病毒（CSFV）重組E2蛋白作為包被抗原，辣根過氧化物酶標(biāo)記的E2蛋白中和性單克隆抗體作為競爭抗體，建立了一種用于檢測CSFV中和抗體的重組E2蛋白競爭抑制ELISA（CIELISA）方法。Ma L N等［8］通過對(duì)比超過100篇ELISA用于FMD診斷及抗原分析的文獻(xiàn)中ELISA的靈敏度和特異性，發(fā)現(xiàn)抗體捕獲競爭性ELISA有更高的特異性，而RT-PCR ELISA有較高的靈敏度。

2.2.2 血凝及血凝抑制試驗(yàn) 血凝（HA）及血凝抑制（HI）試驗(yàn)在新城疫和豬流感等的診斷中有一定的應(yīng)用。由于NDV病毒粒子囊膜上的血凝素能凝集雞和多種動(dòng)物的紅細(xì)胞，出現(xiàn)所謂紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象（HA），而NDV作為抗原進(jìn)入雞體后產(chǎn)生的抗血凝素抗體又能抑制此凝集現(xiàn)象的發(fā)生（HI），所以HA和HI試驗(yàn)可以應(yīng)用于對(duì)NDV進(jìn)行定性和定量檢測。而豬流感病毒（SIV）顆粒表面的HA蛋白具有識(shí)別并吸附紅細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，HA蛋白的抗體與該蛋白受體的特異性結(jié)合能夠抑制HA蛋白與紅細(xì)胞受體的結(jié)合，故而在豬流感的診斷中血凝試驗(yàn)也是常用的方法之一。

2.2.3 免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn) 免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）可用于診斷高致病性豬藍(lán)耳病和豬流感等疫病。目前歐洲國家廣泛應(yīng)用IPMA診斷高致病性豬藍(lán)耳病，其敏感性和特異性都比較好，可用于PRRSV的病毒鑒定及血清抗體檢測。該技術(shù)也可用于檢測豬血清中的SIV抗體，其特點(diǎn)是特異性強(qiáng)，可檢出感染3d后的抗體效價(jià)。譚斌等［9］建立了一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）血清抗體的免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA），并組裝成PRRSV-IPMA抗體檢測試劑盒，該試劑盒檢測PRRSV抗體具有較高的特異性和敏感性。

常用的中和試驗(yàn)有兩種方法，即固定血清-稀釋病毒法（病毒中和試驗(yàn)）和固定病毒-稀釋血清法（血清中和試驗(yàn)），在豬流感、高致病性豬藍(lán)耳病和口蹄疫等的診斷中都有一定的應(yīng)用。血清中和試驗(yàn)（SN）是較敏感、特異的血清學(xué)方法，但只有抗體與病毒上的表面抗原相對(duì)應(yīng)，特別是與吸附到宿主細(xì)胞上的病毒表面抗原相對(duì)應(yīng)時(shí)才能取得確切的試驗(yàn)結(jié)果［10］。SN在研究應(yīng)用中較廣泛，但其存在操作復(fù)雜、時(shí)間較長（1周左右）等缺點(diǎn)，故較少用于臨床進(jìn)行疾病早期診斷。而病毒中和試驗(yàn)（VN）是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的檢測口蹄疫病毒抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法。VN的優(yōu)點(diǎn)是既可以鑒定抗原，又可以對(duì)血清抗體進(jìn)行定量測定，缺點(diǎn)是需要培養(yǎng)單層細(xì)胞或飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［11］。

2.2.4 免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，其原理是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出一種特異性熒光。免疫熒光技術(shù)又可分為直接法和間接法，其在新城疫、豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病、豬流感等的診斷中都有一定的應(yīng)用。王元［12］利用PRRSV單克隆抗體1D12作為一抗，建立了在冰凍切片中快速檢測PRRSV抗原的免疫熒光方法，該方法可用于PRRSV感染的實(shí)驗(yàn)室快速診斷。免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快，許多國家已將它作為執(zhí)行豬瘟消滅計(jì)劃的法定診斷試驗(yàn)［13］。但其非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也比較復(fù)雜，且需要熒光顯微鏡，設(shè)備較昂貴。

2.3 分子生物學(xué)診斷方法

2.3.1 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）因其具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為最為廣泛地應(yīng)用于診斷重大疫病的分子生物學(xué)技術(shù)之一。核酸探針技術(shù)是利用核苷酸堿基順序互補(bǔ)的原理，用特異的基因探針即識(shí)別特異堿基序列（靶序列）的有標(biāo)記的一段單鏈DNA（或RNA）分子，與被測定的靶序列互補(bǔ)，以檢測被測靶序列的技術(shù)。因?yàn)槊恳环N病原都具有獨(dú)特的核酸片段，通過分離和標(biāo)記這些片段就能制備出探針，用于疾病的診斷等研究。呂翠等［23］以地高辛（DIG）標(biāo)記豬流感病毒M基因的保守片段制成核酸探針，該核酸探針特異性強(qiáng)、敏感性高，最低能檢出約5pg的H3亞型SIV RT-PCR產(chǎn)物。核酸探針技術(shù)具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，但需要合成核酸探針，診斷費(fèi)用較高。應(yīng)用RT-PCR已成功測定了多株CSFV的全基因序列，為豬瘟致病機(jī)理、免疫機(jī)制、檢測防控提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［13］。薄清如等［14］分別建立了FMDV群、O型和Asia1型特異性實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法，設(shè)計(jì)了FMDV的3D、VP3和3C區(qū)域的引物和探針，結(jié)果是3種FMDV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法均具有良好的特異性，可以很好地將FMDV與傳染性牛鼻氣管炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、赤羽病病毒和豬呼吸系統(tǒng)冠狀病毒區(qū)分。Lurchachaiwong W等［15］對(duì)比了用于快速檢測PRRSV的傳統(tǒng)RT-PCR方法和基于傳統(tǒng)RTPCR建立的兩種新方法（一種使用嵌合熒光法，另一種使用探針化學(xué)法），結(jié)果顯示兩種方法都能用于PRRSV的快速檢測，其靈敏度分別為104copies／μL和103copies／μL。陳堅(jiān)等［16］在保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件，建立了一種可檢測出多種亞型豬源流感病毒的RT-PCR方法，且該方法具有高特異性和敏感性，適用于SIV的診斷和推廣應(yīng)用。Leifer I等［17］描述了一種以NS5A區(qū)域?yàn)槟０宓男滦虲SFV rRT-PCR系統(tǒng)，該方法能在不依賴5′非編碼區(qū)的前提下提供對(duì)CSFV基因組的可靠檢測。Zhang L等［18］闡述了一種快速、靈敏、精確的半套式RT-PCR用于診斷區(qū)分新城疫強(qiáng)毒和無毒毒株。

2.3.2 基因芯片 基因芯片的基本原理是將大量已知序列的寡聚核苷酸探針固定在玻璃等支持物上，然后與待測樣本的DNA或RNA進(jìn)行雜交，通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。該法可以同時(shí)完成對(duì)樣品中多個(gè)序列的檢測和分析。由于其具有的高通量、高集成、微量化、自動(dòng)化、污染少、可多基因多標(biāo)本平行檢測等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于病原分型和疾病診斷。楊忠蘋等［19］開發(fā)了可同時(shí)區(qū)分H5、H7、H9亞型血凝素及N1、N2神經(jīng)氨酸酶亞型的DNA芯片診斷技術(shù)，該方法可以快速診斷禽流感病毒的部分亞型。葉芬等［20］建立豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）基因芯片快速檢測體系。該基因芯片檢測方法和PCR／RT-PCR檢測檢測方法符合率高達(dá)92%，表明該檢測技術(shù)能夠用于臨床病料的檢測及快速診斷PRRSV、CSFV和PCV-2感染。楊若松等［21］建立豬瘟病毒（CSFV）、高致病性豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）及豬細(xì)小病毒（PPV）的基因芯片檢測方法，對(duì)臨床150份樣品的檢測結(jié)果顯示，該方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。王建東等［22］完成了口蹄疫病毒基因芯片的制備。這些研究為基因芯片在高致病性動(dòng)物疫病的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.4 其他診斷方法

2.4.1 逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）是近幾年才使用的一種新方法。LAMP是2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（63℃左右）保溫30min～60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。相較于傳統(tǒng)PCR，其具有以下優(yōu)點(diǎn)，擴(kuò)增效率高，特異性強(qiáng)，靈敏度高，成本低，大大縮短反應(yīng)時(shí)間。秦智鋒等［24］建立了FMDV RT-LAMP的檢測方法，作者設(shè)計(jì)了6條針對(duì)FM2DV 3D基因的8個(gè)位點(diǎn)的特異性引物，從RNA的提取到檢測僅需要75 min。其優(yōu)點(diǎn)是程序簡單、靈敏度和特異性高，適合現(xiàn)場檢測，缺點(diǎn)是FMDV RNA抽提過程要在特定實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。Yin S H等［25］建立了CSFV RT-LAMP的檢測方法，該RT-LAMP檢測方法具有比RT-PCR更高的靈敏性，且與其他相關(guān)豬病毒沒有交叉反應(yīng)出現(xiàn)。

2.4.2 生物傳感器 生物傳感器是指由一種生物敏感部件和轉(zhuǎn)換器緊密結(jié)合，對(duì)特定種類化學(xué)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置。其中DNA傳感器是目前生物傳感器中報(bào)道最多的一種，用于臨床疫病診斷是DNA傳感器的最大優(yōu)勢，它可以幫助動(dòng)物衛(wèi)生工作者從DNA、RNA、蛋白質(zhì)及其相互作用層次上了解疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，有助于對(duì)疾病的及時(shí)診斷和治療。國外已經(jīng)有研究報(bào)道將生物傳感器應(yīng)用于口蹄疫的診斷檢測。王海靜［26］建立了一種應(yīng)用SPR生物傳感器快速檢測H5亞型禽流感病毒和A型流感病毒的方法，該方法具有快速、敏感、特異等特點(diǎn)。Wang R H等［27］研究了一種便攜式阻抗生物傳感器，用于檢測禽流感，這種阻抗生物傳感器技術(shù)比rRT-PCR具有更高的靈敏度和特異性，且檢測所用時(shí)間少于1h。

2.4.3 納米技術(shù) 納米技術(shù)是指在納米尺度下對(duì)物質(zhì)進(jìn)行制備、研究和工業(yè)化以及利用納米尺度物質(zhì)進(jìn)行交叉研究和工業(yè)化的一門綜合性技術(shù)體系。將納米技術(shù)應(yīng)用到動(dòng)物重大疫病診斷研究中，是現(xiàn)代科學(xué)應(yīng)用的新發(fā)展。張鑫宇等［28］針對(duì)非洲豬瘟病毒（ASFV）p72基因序列，制備了特異性納米金標(biāo)記探針。PCR擴(kuò)增出的p72基因中的651bp保守核酸序列，變性后與上述生物素探針及標(biāo)記納米金探針進(jìn)行雜交，雜交產(chǎn)物加入吸附鏈霉親和素的酶標(biāo)板，銀染增強(qiáng)法對(duì)納米金標(biāo)記探針進(jìn)行信號(hào)放大。結(jié)果表明，制備的納米金探針經(jīng)銀染放大后，在酶標(biāo)板中形成肉眼可見的黑色沉淀，可有效檢測擴(kuò)增出的p72基因，檢測核酸濃度達(dá)到10fmol／L，可用于ASF快速診斷。目前熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)中使用的引物是通過熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，但熒光染料穩(wěn)定性差、檢測光譜范圍小。納米材料制成的發(fā)光物具有光譜范圍廣、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。金、銀納米粒子標(biāo)記物，在加入了熒光染料后，可以更方便的看到特定受體和蛋白發(fā)生反應(yīng)。由于納米標(biāo)志物在同一光譜下可以有多種熒光，所以可以同時(shí)標(biāo)記多個(gè)探針，對(duì)樣品同時(shí)進(jìn)行多種核酸檢測，大大提高了檢測的效率。

3 展望

近幾年來重大動(dòng)物疫病的防控研究已有了很大突破。在診斷方面，傳統(tǒng)診斷方法得到不斷改進(jìn)，新的診斷技術(shù)不斷產(chǎn)生，其中血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)已經(jīng)成為重大動(dòng)物疫病診斷方法之一，而在這兩種診斷方法中，ELISA、PCR成為檢測疫病病原的主要方式。同時(shí)新技術(shù)如基因芯片技術(shù)也逐漸成熟并廣泛應(yīng)用于疫病診斷。但是從以上所述可以看出，有的方法靈敏度不高、特異性不強(qiáng)，有的方法檢測時(shí)間過長，有的方法成本偏高，有的方法則需要特殊的實(shí)驗(yàn)環(huán)境或需要特殊的儀器設(shè)備。因此，找到一種快捷、方便、廉價(jià)、高效、操作性強(qiáng)的檢測方法依然是今后研究的熱點(diǎn)。

當(dāng)前，納米技術(shù)正成為各國科技界所關(guān)注的焦點(diǎn)。納米材料的特殊結(jié)構(gòu)決定了它的特殊性能，它可以產(chǎn)生四大效應(yīng)，即小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)（含宏觀量子隧道效應(yīng)）、表面效應(yīng)和界面效應(yīng)，從而表現(xiàn)出許多優(yōu)異性能和全新的功能。雖然納米技術(shù)在動(dòng)物重大疫病診斷研究中的應(yīng)用時(shí)間不長，但由于納米材料理化性質(zhì)的奇特性，它的應(yīng)用潛力非常大。納米技術(shù)作為一項(xiàng)新興技術(shù)將在動(dòng)物醫(yī)學(xué)中發(fā)揮積極的作用，在動(dòng)物疫病研究和應(yīng)用上也將產(chǎn)生新的突破。

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