阿苯達唑-聚乙二醇6000固體分散體殼聚糖微球的制備與藥劑學性質研究Δ

王曉青，劉揚，陳袁蘭，朱愛軍，張光宇，張學農(nóng)#，任偉新，迪理木拉提·巴吾東，顧俊鵬，許曉東（.蘇州大學醫(yī)學部藥學院，江蘇蘇州 53；.新疆醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，烏魯木齊 830054）

阿苯達唑（Albendazole，ABZ）為苯并咪唑類廣譜抗寄生蟲藥，是治療泡球蚴病和細粒棘球蚴病的首選藥物之一，研究[1，2]證明，由于ABZ的低溶解性和在體內廣泛的分布性，極大影響了其吸收及生物利用度，且療效與其溶解性呈正相關，因此，提高ABZ溶解度和口服生物利用度或研究其新型肝動脈栓塞微球制劑是目前治療包蟲病的有效途徑。

固體分散體是提高難溶性藥物溶解度和生物利用度的有效途徑，且工藝簡單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)[3，4]。本課題以親水性材料聚乙二醇6000（PEG）為載體，采用了固體分散技術制備ABZ固體分散體（ABZ-SD，ASD）。同時，利用殼聚糖（Chitosan，CS）為天然的陽離子聚合物，具有無毒、生物相容性好、體內降解產(chǎn)物易被人體吸收、毒副作用小的特點[5]。以ASD為主體、殼聚糖為載體材料，采用乳化交聯(lián)法制備殼聚糖骨架型微球，以達到提高ABZ生物利用度、穩(wěn)定性和延長其體內作用時間的目的。

1 儀器與試藥

UV2401-PC型紫外分光光度計（日本島津公司）；ME215S型分析天平（德國賽多利斯公司）；pHS-3TC型數(shù)顯pH計（上海天達儀器有限公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；S-4700冷場發(fā)射掃描電鏡（日本日立公司）；Mercury CCD X射線單晶衍射儀（日本理學電機株式會社）；DSC 2010熱分析儀（美國TA Instruments公司）。

ABZ（武漢遠城科技發(fā)展有限公司，批號:090901，純度:99.16%）；殼聚糖（浙江澳興生物科技有限公司，分子量Mw:50 kDa，脫乙酰度:93%）；ASD（蘇州大學自制，載藥量:20%）；PEG、司盤（Span）-80、液體石蠟、25%戊二醛、甲醇（色譜純）均由國藥集團化學試劑有限公司提供；其余試劑均為分析純。

2 ASD的制備及鑒別、表征

2.1 制備方法

取PEG油浴80℃熔融，于攪拌狀態(tài)加入ABZ，使藥物均勻分散在熔融的載體（PEG）后傾倒于預冷4℃玻璃板上冷卻固化。－18℃冷凍20 min后干燥24 h，粉碎過230目分樣篩備用。

2.2 平衡溶解度的測定[6]

分別取ABZ、ABZ與不同比例PEG（藥載比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）的固體分散體（ASD1～ASD6），置于蒸餾水中，35℃恒溫振搖3 d，至其溶解度不變?yōu)橹?；靜置，取上清液過0.45 μm濾膜，紫外295 nm波長測定其吸光度并計算其溶解度。結果，隨著載體比例的增加，ASD的溶解度呈增加趨勢，當藥載比為1∶6時（ASD6），其溶解度達到原藥溶解度的31.09倍，結果詳見表1。

表1 溶解度試驗結果（n＝3）Tab 1 Results of solubility experiment（n＝3）

取上述ASD同批次制備微球，分別測定其包封率和載藥量，結果顯示藥物在微球中的包封率和載藥量并不是隨著載體比例的增加而增加，當藥載比為1∶4時，其包封率和載藥量最高。推測原因可能是載體比例過大，藥物的溶解度顯著增加的同時易通過油水界面擴散至水相[7]，導致其包封率降低，故最終ASD的藥載比確定為1∶4。

2.3 ASD的鑒別與表征

2.3.1 掃描電鏡觀察。取適量ABZ及ASD（1∶4），用導電膠帶粘結固定后濺金，并固定在樣品臺上，對準架臺的槽溝送入到停止點為止，然后抽真空觀察粉末形態(tài)。二者掃描電鏡照片見圖1。

由圖1可知，ABZ呈砂晶分布，而ASD呈無定形存在，表明藥物由于晶型的改變而使其溶解度增大。

2.3.2 紅外光譜。分別取ABZ、ABZ與PEG物理混合物、ASD、PEG，在波數(shù)400～4 000 cm－1內掃描進行紅外光譜測定，詳見圖2。

由圖2顯示，ASD與物理混合物在指紋區(qū)和其他區(qū)域均基本相似，說明ABZ的化學結構未發(fā)生變化，且ASD的紅外光譜只是ABZ與PEG光譜的簡單疊加，表明藥物與載體之間并未發(fā)生氫鍵效應等作用，ASD中無新的復合物產(chǎn)生。

圖1 掃描電鏡圖Fig 1 TEM

圖2 固體分散體紅外光譜圖Fig 2 FT-IR spectra of solid dispersions

3 ABZ含量測定方法的建立[8]

精密稱取ABZ 10 mg置于25 mL量瓶中，加冰醋酸1 mL，溶解后加甲醇至刻度作為儲備液；分別精密量取儲備液0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到不同濃度的一系列溶液，搖勻；在295 nm波長下測定，以吸光度（A）和濃度（c）進行回歸，得其線性方程為:c＝0.040 6A+0.017（r＝0.999 4），ABZ檢測濃度線性范圍為1～20 μg·mL－1。按相關方法進行回收率和精密度試驗，結果，低、中、高濃度回收率分別為101.3%、100.4%、99.42%，平均回收率為100.37%（RSD＝0.94%）；平均日內RSD＝0.21%，日間RSD＝0.88%。

首先，推進利率市場化。銀行業(yè)高利潤為有序推進利率市場化創(chuàng)造了良好機遇。當前，應鼓勵銀行多向中小企業(yè)提供融資服務，完善銀行貸款利率的風險定價機制，以實現(xiàn)我國經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)結構和收入分配結構的不斷優(yōu)化。

4 ABZ-PEG殼聚糖微球的制備與藥劑學性質評價

4.1 微球的制備

取ASD緩慢加入已溶脹好的殼聚糖溶液超聲溶解即得水相，將水相逐滴（1滴/2 s）加入至含乳化劑Span-80的液體石蠟中，恒速乳化后加戊二醛交聯(lián)固化2 h，石油醚、異丙醇清洗，40℃干燥15 h，即得ABZ-PEG殼聚糖微球；不加ASD即得空白殼聚糖微球。

4.2 包封率和載藥量的測定

取研細的微球加冰醋酸消解，甲醇定容至50 mL，搖勻，295 nm波長處測定吸光度，由下面公式計算載藥量和包封率:載藥量＝（微球中ABZ的重量/微球重量）×100%；包封率＝（微球中ABZ的重量/ABZ投藥量）×100%。

4.3 微球制備工藝優(yōu)化

結合文獻[9]以及單因素考察試驗結果，選定對微球包封率、載藥量、粒徑分布和產(chǎn)率影響較大的Span-80含量（A）、殼聚糖濃度（B）以及油-水（液體石蠟-含藥殼聚糖溶液）比例（C）為影響因素，設定處方總量為70 mL，加入藥物量為140 mg，采用L9（34）正交表安排試驗，以a（平均粒徑，μm）、b（產(chǎn)率，產(chǎn)率＝干燥后微球總量/（ABZ投藥量+殼聚糖量）×100%，%）、c（包封率，%）、d（載藥量，%）為指標，分別給4個指標賦予－0.3、－0.1、0.3、0.3的權重，采用綜合加權評分法進行正交設計。粒徑評分＝－0.3×a/目標粒徑；產(chǎn)率評分＝－0.1×b/最大產(chǎn)率；包封率評分＝0.3×c/最高包封率；載藥量評分＝0.3×d/最大載藥量。故綜合評分＝粒徑評分+產(chǎn)率評分+包封率評分+載藥量評分＝－0.3×a/200－0.1×b/91.12+0.3×c/67.19+0.3×d/6.91。因素水平見表2，正交結果見表3，方差分析見表4。

表2 因素水平表Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗結果Tab 3 Results of orthogonal design

表4 方差分析表Tab 4 Analysis of variance

由直觀分析結果判斷，3因素極差大小依次為A＞B＞C，再綜合方差分析，其中Span-80的用量和殼聚糖濃度對綜合評分有顯著性影響（P＜0.05），因此，3因素的最佳組合為A3B3C2。最終確定的較佳處方工藝為Span-80的含量:0.015 g·mL－1，殼聚糖濃度:2.2%，油-水比例:10∶1。

4.4 驗證試驗

采用較優(yōu)工藝處方制備微球，重復5次，同等條件測定上述指標。結果，包封率為（57.86±0.74）%（RSD＝1.27%），載藥量為（6.42±0.32）%（RSD＝1.87%），粒徑為（210±3.8）μm（RSD＝1.8%），產(chǎn)率為（85.77±1.5）%（RSD＝1.74%）。結果表明，較優(yōu)工藝處方制備微球達到了預期目標，且工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好。

4.5 微球的藥劑學性質評價

4.5.1 形態(tài)粒徑考察。取微球適量均勻撒布在載玻片上以計數(shù)法測定其平均粒徑，用電鏡觀察（30倍）微球的表面形態(tài)及特征，見圖3A；另取制備后微球及放置2個月后的微球，用掃描電鏡放大300倍觀察微球表面形態(tài)，詳見圖3B、圖3C。

圖3結果表明，微球形態(tài)圓整，粒徑分布均勻，平均粒徑約210 μm，表面光滑、圓整，互不粘連，分散性好。

圖3 微球形態(tài)電鏡圖Fig 3 Appearance of MS under electric microscope

4.5.2 粉體學性質考察。取10 g微球，分別進行圓整度、壓縮度及休止角等粉體學性質的考察。（1）圓整度:取定量微球置于平板上，將平板一側抬起，測量微球滾動前傾斜平面與水平面的夾角。（2）壓縮度:取定量微球輕裝入量筒中測量最初疏松體積；在桌面上輕敲至體積不再減小為止，測量最終體積；計算最松密度ρ0和最緊密度ρf，計算壓縮度C＝（ρf－ρ0）/ρf×100%。（3）休止角:測量漏斗的高度和形成圓錐體的半徑，計算休止角。3批樣品結果詳見表5。

表5 微球粉體學性質考察Tab 5 Micromeritics properties of microspheres

表5結果表明，所制微球分散性和流動性均良好。

4.5.3 微球的結構表征。（1）紅外光譜:取ABZ、殼聚糖、物理混合物（ABZ、PEG、殼聚糖）及藥物微球進行紅外光譜測定，結果見圖4。

圖4 微球紅外光譜圖Fig 4 FT-IR spectra of microspheres

由圖4可見，微球中藥物與PEG的特征峰均消失，說明藥物已包載其中。

（2）X衍射分析。取“4.5.3”（1）項下4種樣品進行X衍射分析，結果見圖5。

由圖5可見，微球中藥物結晶峰全部消失，而在物理混合物中仍大量存在，證明了藥物已被包埋在殼聚糖微球骨架中，而不是以物理混合物的形式存在。

5 微球的釋放行為

稱取微球100 mg置于透析袋中，加4 mL釋放介質，用棉繩扎緊封口，固定于螺旋槳上，分別置于（37±0.5）℃、250 mL的0.1 mol·L－1鹽酸、pH 3.5的醋酸鹽溶液、pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）釋放介質中，根據(jù)2010年版《中國藥典》二部附錄ⅩC中小杯法[10]操作，測定藥物累積釋放率。調整轉速為100 r·min－1，分別于1 、2 、4、6、12 h，1、2、3、4、8、10 d取樣4.0 mL，同時補充同溫介質4.0 mL。樣液用0.45 μm微孔濾膜過濾，紫外法測定其吸光度值，微球在3種介質中的釋放情況詳見圖6。

圖5 X衍射分析圖Fig 5 X-ray diffraction

圖6 微球在3種介質中的體外釋放曲線Fig 6 Release profiles of microspheres in 3 kinds of medium in vitro

圖7 3種樣品在pH3.5醋酸鹽溶液中的體外釋放曲線Fig 7 Release profiles of 3 samples in pH3.5 acetate so lution

由圖6可見，微球在pH3.5醋酸鹽溶液中釋放更優(yōu)，微球前30 min內，釋放率低于40%，基本不產(chǎn)生突釋現(xiàn)象；同時總體釋放程度顯著提高，顯示出其顯著緩釋效果。故選其作為微球的釋放介質，同時以ABZ、ASD作為對照。由于固體分散體使原料藥溶出度得到大幅度改善，故延長各樣品釋放時間至17 d（408 h）。3種樣品體外釋放詳見圖7。

將ABZ、ASD及微球釋放時間（t）與藥物的累積釋放率（Q）分別用一級釋放模型、威布爾（Weibull）函數(shù)、Higuchi方程進行擬合，結果見表6。

表6 3種樣品釋放曲線擬合方程Tab 6 Regression equations for drug release of 3 samples in vitro

以各方程的相關系數(shù)為指標，結果發(fā)現(xiàn)ASD和微球在介質中的釋放行為按Higuchi方程擬合效果較好，且Higuchi系數(shù)分別為0.021 6、0.026 4，表明微球的釋放模式符合殼聚糖微球的孔道擴散機制。同時釋放曲線和擬合方程均顯示所制備微球有顯著的緩釋效果。

6 討論

ABZ水溶性極差，但易溶于冰醋酸，而殼聚糖易溶于稀酸溶液，將ABZ制備為親水性材料固體分散體后，水溶性顯著提高，降低了其對高濃度醋酸的依賴性，進而可均勻分散在殼聚糖的稀酸溶液中，為微球的制備提供了可能性；殼聚糖體內降解產(chǎn)物易被人體吸收，毒副作用小，在緩釋給藥系統(tǒng)中應用非常廣泛。

以平均粒徑、產(chǎn)率、包封率和載藥量為指標篩選處方和制備工藝，結果表明轉速是影響微球粒徑大小及分布的主要因素，隨著轉速增大，微球的平均粒徑逐漸減小，當轉速低于500 r·min－1，平均粒徑增大且分布不均。經(jīng)過反復調整，最終確定以750 r·min－1的轉速進行處方優(yōu)化。同時，ASD的粉碎程度直接影響微球的圓整度，當ASD粉末不能過200目分樣篩時，所制微球表面突起不平，不利于栓塞給藥。

ASD能顯著提高藥物的溶解度，其原因主要是載體材料PEG可有效抑制藥物結晶，使其成為無定形高分散的狀態(tài)；固體分散體具有較大的表面積，隨著可溶性載體的降解，藥物可在骨架中緩慢釋放。同時釋放曲線顯示，ASD溶出速率明顯快于ABZ。本法制備的微球吸附藥物較少，前期釋放的藥物主要是處于微球孔道內的藥物，殼聚糖溶脹使得微孔口徑減小甚至通道關閉，隨后的藥物釋放通過骨架慢慢地擴散或通過殼聚糖的降解慢慢地釋放。由釋放曲線可知，通過乳化交聯(lián)法制成的ASD殼聚糖微球具有良好的緩釋性能。

固體分散體同時面臨著貯放時間長后易老化的缺點，這是因為其中的藥物物理結構發(fā)生了改變，成為無定形而存在，有轉化為穩(wěn)定的藥物結晶的趨勢。這可通過添加表面活性劑、多元載體等方法改進工藝等解決，本試驗將制得的固體分散體在短期內制備成微球可以有效地防止其老化。經(jīng)過優(yōu)化工藝制備的微球表面光滑、球形圓整。通過篩選分級后得到不同粒徑段的微球，可滿足體內各大、中、小血管栓塞的要求。

[1]王建華，溫 浩，孫殿甲.阿苯達唑的體內過程和劑型研究進展[J].中國寄生蟲病防治雜志，2002，15（3）:187.

[2]Venkatesan P.Albendazole[J].J Antimicrob Chemother，1998，41（2）:145.

[3]張 波，張東娜，王洪權，等.難溶性藥物增溶技術的研究進展[J].解放軍藥學學報，2009，25（5）:425.

[4]杜光玲，趙燕燕，劉會芳，等.洛伐他汀固體分散體的制備和體外溶出度[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2008，39（8）:598.

[5]Lim ST，Mrtin GP，Berry DJ，et al.Preparation and evaluation of the in vitro drug release properties and mucoadhesion of novel microspheres of hyaluronic acid and chitosan[J].J Control Release，2000，66（5）:281.

[6]徐曉弘，翟所迪.阿苯達唑固體分散物制備及體外溶出特性研究[J].中國藥學雜志，2002，37（4）:283.

[7]O’Donnell PB，McGinity JW.Preparation of microspheres by the solvent evaporation technique[J].Adv Drug Deliv Rev，1997，28（1）:25.

[8]張學農(nóng)，張 強，溫 浩，等.乳化聚合法制備阿苯達唑聚氰基丙烯酸酯納米球的方法比較及穩(wěn)定性考察[J].中國藥學雜志，2003，38（5）:357.

[9]劉 純，金夢瑤，張學農(nóng)，等.絲素蛋白-殼聚糖雙氯芬酸鈉緩釋微球的制備與特性研究[J].中國新藥雜志，2009，18（16）:1 566.

[10]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅩC.