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    微生物方法降解刺參養(yǎng)殖池塘中氨態(tài)氮的研究進(jìn)展

    2012-03-20 00:57:26李燕崔杰鑫趙文
    微生物學(xué)雜志 2012年3期
    關(guān)鍵詞:氨態(tài)異養(yǎng)刺參

    李燕,崔杰鑫,趙文

    (大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省水生生物重點(diǎn)實(shí)驗室,遼寧大連116023)

    近年來,刺參養(yǎng)殖業(yè)走上發(fā)展的快車道,迅速成為高經(jīng)濟(jì)效益的產(chǎn)業(yè)[1],刺參的養(yǎng)殖密度也越來越高。過高的養(yǎng)殖密度給養(yǎng)殖水體帶來了氮元素輸入和產(chǎn)出的嚴(yán)重不平衡,導(dǎo)致水體氨態(tài)氮,亞硝酸態(tài)氮大量積累[2]。養(yǎng)殖水體中高濃度的氮元素極易引發(fā)刺參的病害和死亡,也嚴(yán)重破壞了養(yǎng)殖系統(tǒng)的氮循環(huán)平衡體系[3]。如何有效控制養(yǎng)殖水體的氮污染一直是水產(chǎn)養(yǎng)殖研究的重要問題之一,目前研究較多的是采用微生物方法[4-5]。本文綜述了氨氮的危害、微生物對降解氨氮和微生物降解法的實(shí)際應(yīng)用,并對該方法的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

    1 氨態(tài)氮對刺參的毒害

    我國的刺參養(yǎng)殖多采用封閉式,隨著養(yǎng)殖時間的增加,刺參的糞便、殘餌、其他生物的排泄物以及一些浮游動植物的尸體不斷在池塘底部積累,富集在池底的這些污染物在一定條件下會向養(yǎng)殖水體中釋放無機(jī)氮如N、NO2--N,尤以-N的毒性為最大[3,6-7]。氮污染對刺參的毒性機(jī)制還不是很清楚,一般比較認(rèn)同的解釋是:氨態(tài)氮能通過刺參體表深入機(jī)體內(nèi),釋放OH-,促使體液pH升高,對酶水解反應(yīng)和膜穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響,表現(xiàn)為呼吸困難、不攝食、抵抗力下降等現(xiàn)象導(dǎo)致刺參大批量死亡[8];認(rèn)為高濃度的氨態(tài)氮會取代刺參體內(nèi)的鉀離子,影響神經(jīng)系統(tǒng)工作,引起N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體結(jié)合活性明顯降低,導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中流入過量的鈣離子并引起細(xì)胞死亡[9]。刺參生活過程中也會以氨態(tài)氮的形式向環(huán)境中排泄氮元素,當(dāng)外界水環(huán)境氨態(tài)氮含量過高時會抑制刺參的排泄,進(jìn)而影響其自身的生長。

    2 微生物對氨態(tài)氮的降解

    微生物脫氮技術(shù)能夠有效去除刺參養(yǎng)殖池塘中高含量的氮元素,具有十分重要的意義和極大的實(shí)用價值,尤其是在降解池塘氨態(tài)氮方面作用更大[10]。在養(yǎng)殖池塘中,微生物降解氨態(tài)氮過程主要發(fā)生在沉積物中,這個過程占據(jù)了整個養(yǎng)殖池塘氮循環(huán)的關(guān)鍵步驟[11]。微生物降解氨態(tài)氮的過程主要由兩大類細(xì)菌完成:自養(yǎng)硝化細(xì)菌和異養(yǎng)硝化細(xì)菌。自養(yǎng)硝化細(xì)菌將水體中氨態(tài)氮轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}態(tài)氮和硝酸態(tài)氮,并從該氧化過程中獲得能量,同化無機(jī)碳化合物CO32-、HCO3-和CO2,合成細(xì)胞物質(zhì)[10]。自養(yǎng)硝化細(xì)菌降解氨態(tài)氮分2個相對獨(dú)立而又聯(lián)系緊密的階段。前一階段NH3氧化為NO2-,成為亞硝化作用或氨氧化作用,由亞硝化細(xì)菌完成;后一階段是NO2-氧化為NO3-的過程,稱為硝化作用,由硝化細(xì)菌完成。所以,常說的硝化作用實(shí)際上包括了上述2個階段[11-12]。異養(yǎng)硝化細(xì)菌在某些特定的環(huán)境中進(jìn)行化能異養(yǎng),能分別將氨態(tài)氮和亞硝酸鹽等氧化成亞硝酸鹽和硝酸鹽。異養(yǎng)硝化細(xì)菌可利用的氮源比較多,包括無機(jī)氮(NH3、NO2-)和有機(jī)氮(胺、酰胺、N-烷基羥胺、芳香硝基化合物等),這是異養(yǎng)硝化細(xì)菌不同于自養(yǎng)硝化細(xì)菌的特點(diǎn)之一。正因為異養(yǎng)硝化細(xì)菌可以利用的氮源比較多,所以異養(yǎng)硝化作用的底物及其代謝途徑至今仍不太清楚[10]。

    3 高效氨氮降解菌株的篩選、鑒定和固定

    自養(yǎng)硝化細(xì)菌生長緩慢,代謝周期較長,無法在有機(jī)物含量高的刺參池塘底泥中和異養(yǎng)菌競爭,這導(dǎo)致自養(yǎng)硝化細(xì)菌難以形成優(yōu)勢種群。同時,自養(yǎng)硝化細(xì)菌對外界環(huán)境的變化適應(yīng)能力差,尤其對外界毒性沖擊敏感,一旦自養(yǎng)硝化細(xì)菌的降解體系受到損害很難恢復(fù)[2,13]。因此,對水體環(huán)境要求高,生長速度緩慢,生物量小,難以快速處理水質(zhì)急劇惡化問題,是自養(yǎng)硝化細(xì)菌難以在刺參養(yǎng)殖池塘的氨態(tài)氮降解上發(fā)揮重要作用的主要原因[14]。在降解養(yǎng)殖水體氨態(tài)氮方面,異養(yǎng)硝化細(xì)菌有其獨(dú)特的優(yōu)勢。首先,異養(yǎng)硝化細(xì)菌生長速率快,能在短時間內(nèi)成為池塘微生物生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢種群,利用水體中的氨態(tài)氮[10]。其次,異養(yǎng)硝化細(xì)菌成為微生物生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢種群后還能夠與致病菌競爭空間、營養(yǎng)物質(zhì),產(chǎn)生胞外產(chǎn)物抑制病原菌的生長[14-16]。因此,如何篩選高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌來降解養(yǎng)殖水體氨態(tài)氮成了近年來的研究課題。

    3.1 高效降解菌株的來源

    研究發(fā)現(xiàn),某些陸生動物使用的益生菌可以應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[17],但大部分學(xué)者認(rèn)為,從刺參或其周圍養(yǎng)殖環(huán)境中篩選的降解氨態(tài)氮的降解微生物是比較好的候選微生物[14,18]。目前,刺參養(yǎng)殖過程中使用的有降解氨態(tài)氮功能的益生菌多為外來菌株,大量使用將有可能導(dǎo)致外來菌種的入侵,破壞養(yǎng)殖池塘底部原本脆弱的微生物生態(tài)系統(tǒng),進(jìn)而引發(fā)其他病害。

    3.2 高效降解菌株的篩選

    對于任何一種具有降解氨態(tài)氮功能的有益微生物的篩選,如果篩選方法得當(dāng),可以大大減少篩選的工作量,并且不會發(fā)生漏選的問題[19]。對采集樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)是微生物分離的關(guān)鍵步驟之一,其目的是淘汰樣品中競爭能力和生命力弱的菌株,擴(kuò)大具有強(qiáng)競爭能力菌株的生物量以方便復(fù)篩。淘汰樣品中競爭能力弱的菌株可以保證篩選出的菌株應(yīng)用于養(yǎng)殖水環(huán)境后發(fā)揮自身的競爭優(yōu)勢,通過營養(yǎng)競爭等快速繁殖以達(dá)到去除水體氨態(tài)氮的目的[20]。在一種候選菌被用做高效降解菌進(jìn)行工廠化生產(chǎn)之前,有必要證實(shí)其對養(yǎng)殖生物沒有毒害。因此,應(yīng)在正常養(yǎng)殖條件下,用候選的高效降解菌對養(yǎng)殖生物進(jìn)行攻毒實(shí)驗,在確定其無致病性后,再進(jìn)行工廠化生產(chǎn),這是評價該菌株效果是否最佳的有效方法[16]。由于實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境中池塘底質(zhì)各種物質(zhì)含量和實(shí)驗室培養(yǎng)基相差很大,實(shí)驗室的環(huán)境條件和養(yǎng)殖環(huán)境差別也很大,這些都為候選微生物發(fā)揮降解作用增加了困難。所以,在實(shí)驗室條件下篩選得到氨態(tài)氮高效降解菌株后有必要進(jìn)行養(yǎng)殖環(huán)境的復(fù)篩[21]。

    3.3 高效降解菌株的鑒定

    一般來說,細(xì)菌的鑒定至少需要使用3種指標(biāo)同時進(jìn)行驗證。傳統(tǒng)的生理生化方法鑒定微生物需要測定的項目眾多,工作程序繁瑣,耗時長。分子生物學(xué)方法進(jìn)行細(xì)菌鑒定速度快、工作量小,該方法雖然通過了相關(guān)權(quán)威組織的認(rèn)可,但其穩(wěn)定性尚存在一些問題,同時需要配合其他方法來相互印證,從而完成細(xì)菌的鑒定工作。所以,采用傳統(tǒng)的生理生化方法和現(xiàn)代的分子生物學(xué)方法相結(jié)合來鑒定氨態(tài)氮高效降解菌株是比較科學(xué)的方法[22]。

    3.4 高效降解菌株的固定

    由于刺參的糞便、殘餌、其他生物的排泄物以及一些浮游動植物的尸體不斷在池塘底部積累,所以池塘底部是養(yǎng)殖水體中氨態(tài)氮的主要產(chǎn)生場所;另外,池塘底部積累的大量有機(jī)物和營養(yǎng)元素為有害微生物的繁殖提供了營養(yǎng),這些有害微生物的大量繁殖使刺參生活在一個不健康的環(huán)境中,容易發(fā)生病害[11,18]。如果將微生態(tài)制劑直接施用到池塘底部,不僅可以在氨態(tài)氮濃度最高的地方將其利用掉,還能在菌株大量繁殖時抑制有害微生物的繁殖。固定后的高效降解菌株與傳統(tǒng)的懸浮微生物處理法相比降解效率更高[23],而且固定后的降解菌株不容易隨著池塘換水而流失,也提高了菌株對環(huán)境(pH、溫度、有毒物質(zhì)等)的抗沖擊能力[24]。

    通過聚乙烯醇、海藻酸鈉、交聯(lián)樹脂等多聚體化合物將具有降解功效的細(xì)菌包埋,其內(nèi)部空間具有氧擴(kuò)散能力,可以提高菌的降解功效和生長速度[24]。謝冰等[24]研究了海藻酸鈉-氯化鈣方法、聚乙烯醇硼酸法和聚乙烯醇冷凍-解凍法固定硝化細(xì)菌后的硝化速率發(fā)現(xiàn),海藻酸鈉-氯化鈣方法固定的硝化細(xì)菌的硝化速率明顯高于其他2種方法,而且海藻酸鈉-氯化鈣方法的制備過程操作簡單。選擇開發(fā)性能更加優(yōu)良的固定化載體、反應(yīng)器中最佳的細(xì)菌投加量、在實(shí)際應(yīng)用中的穩(wěn)定可靠性以及如何工廠化生產(chǎn)將是今后氨態(tài)氮降解菌株固定化的研究方向[25]。

    4 氨氮降解菌株的應(yīng)用現(xiàn)狀

    閆法軍等[18]從刺參養(yǎng)殖池塘中分離篩選得到1株低溫氨氮降解菌株,鑒定為馬氏副球菌(Paracoccus marcusii),該菌株在低溫(15℃)、低接種量(<5×10-3)條件下5 d后對富集培養(yǎng)基中氨態(tài)氮的降解率高達(dá)98%;經(jīng)馴化后對1~20 g/L質(zhì)量濃度的刺參餌料液中氨態(tài)氮3 d時間的去除率達(dá)91.7%~99.9%。陸錦天和李?。?6]研究了生物凈水劑對南美白對蝦苗種池亞硝酸鹽含量的影響,向池中施用硝化細(xì)菌、芽胞桿菌等生物凈水劑,池水中亞硝酸鹽含量由1.0 mg/L下降至0.1 mg/L,且沒有出現(xiàn)反彈。李卓佳等[27]采用以芽胞桿菌屬菌株為主導(dǎo)的復(fù)合制劑,在養(yǎng)殖斑節(jié)對蝦的池塘中進(jìn)行了3個月的實(shí)驗,結(jié)果表明,實(shí)驗組與對照組相比,氨氮降低了5%以上,溶解氧增加了30%~100%,斑節(jié)對蝦的產(chǎn)量分別提高了50.3%和87.9%。

    雖然在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已有很多使用微生物來降解水體氨氮、亞硝酸鹽和調(diào)節(jié)水質(zhì)的大量報道,但還存在很多問題需要解決:①菌種在人工培育若干代后會出現(xiàn)形態(tài)、生化甚至是降解特性的變化,大多生產(chǎn)企業(yè)沒有很好地監(jiān)控細(xì)菌變異的問題,導(dǎo)致生產(chǎn)的成品出現(xiàn)質(zhì)量問題,有可能把致病菌引入養(yǎng)殖環(huán)境中。Wang等[28]曾報道在養(yǎng)殖草蝦中發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)菌性白斑病(BWSS),懷疑是因大量使用含有枯草芽胞桿菌的益生菌產(chǎn)品所致;②養(yǎng)殖過程中仍然在大量使用廣譜殺菌消毒劑和抗生素,當(dāng)降解菌株與這些藥物交叉使用時,大部分的菌株也被殺死,而不能在養(yǎng)殖池塘中建立穩(wěn)定、有益的微生物群,導(dǎo)致降解菌株收效甚微;③高效氨態(tài)氮降解菌株工廠化生產(chǎn)后,產(chǎn)品中活菌受溫度、環(huán)境氧濃度、光照、濕度等因素影響,在儲存過程中活菌濃度逐漸下降。而且,產(chǎn)品中菌的濃度和固定劑的特性有很大關(guān)系。因此,如何保證產(chǎn)品到達(dá)施用地后仍保持較高的活菌濃度和尋找更加合適的固定劑成為當(dāng)前氨態(tài)氮降解菌株工廠化生產(chǎn)的主要難題;④由于微生物之間具有復(fù)雜的協(xié)同作用,如何將各種降解菌株合理搭配、優(yōu)化組合制造出更加高效的復(fù)合菌制劑產(chǎn)品還需要深入研究以及廣泛的實(shí)踐檢驗[29]。

    5 氨氮降解菌株的實(shí)際應(yīng)用現(xiàn)狀

    在池塘養(yǎng)殖過程中,為刺參提供一個低氨態(tài)氮的水環(huán)境和有益微生物群落是刺參健康、快速生長的前提。傳統(tǒng)方法去除養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮和預(yù)防疾病的方法會破壞養(yǎng)殖池塘中的微生物生態(tài)平衡,因此,使用從池塘分離篩選具有降解氨態(tài)氮功效的益生菌來降低池塘水體氨態(tài)氮具有很大的潛力。歐美、日本等國均主張在水產(chǎn)養(yǎng)殖中采用微生物方法降解養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮和預(yù)防病害的發(fā)生。隨著社會的發(fā)展和對環(huán)保意識的提高,微生物必將替代傳統(tǒng)藥物成為降解養(yǎng)殖水體氨態(tài)氮和預(yù)防病害的優(yōu)良產(chǎn)品,為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)朝著綠色健康方向發(fā)展提供有力的保障。

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