熒光原位雜交技術(shù)檢測對復(fù)發(fā)性膀胱癌的診斷價值

葛永超，馮金順，郭立恒，吳書一，袁志浩，鄭 濤，王道協(xié)

(1.鄭州市第三人民醫(yī)院 泌尿外科 河南 鄭州 450000;2.鄧州市第一人民醫(yī)院 外科 河南 鄧州474150)

尿路上皮癌尤其是膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)率高，在術(shù)后隨訪中如何進(jìn)行早期復(fù)發(fā)檢測是泌尿外科領(lǐng)域目前研究的熱點問題。2008年12月至2011年12月，對膀胱癌術(shù)后隨訪49例患者，應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)分析尿液遺傳學(xué)改變，探討遺傳學(xué)改變與膀胱癌復(fù)發(fā)的關(guān)系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切或者鈥激光切除術(shù)后患者49例。男27例，女12例，年齡35～75歲，中位年齡53歲。入組時隨訪3～10個月，膀胱鏡檢查未見腫瘤復(fù)發(fā)，同時尿細(xì)胞學(xué)檢查、FISH檢查均為陰性。收集20例正常人新鮮晨尿，建立FISH檢測的閾值。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 膀胱鏡、FISH技術(shù)和尿脫落細(xì)胞學(xué)方法。1.2.1 膀胱鏡檢查:由經(jīng)驗和技術(shù)水平相當(dāng)?shù)尼t(yī)師進(jìn)行膀胱鏡檢查。

1.2.2 尿細(xì)胞學(xué)檢查:收集清晨第1次尿50 ml，尿液排出后1～2 h內(nèi)涂片并立即固定，由病理科固定醫(yī)師進(jìn)行。

1.2.3 FISH檢測方法:FISH技術(shù)使用的3、7、17號染色體著絲粒探針和9p21區(qū)帶探針購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。

1.2.3.1 標(biāo)本收集與處理:收集懷疑膀胱腫瘤復(fù)發(fā)患者晨尿200～300 ml，經(jīng)離心、去雜質(zhì)、胃蛋白酶消化、變性［(76±1)℃水浴鍋中］、雜交、洗滌、復(fù)染等試驗步驟處理。

1.2.3.2 FISH結(jié)果觀察:參照葛永超［1］方法進(jìn)行。即在日本OLYMPUS-BX51熒光顯微鏡下，選用合適的濾波片觀察熒光信號和雜交效果，以細(xì)胞核中有雜交信號的細(xì)胞≥75%為有效標(biāo)本，對有效標(biāo)本進(jìn)行計數(shù)、攝圖保存。

1.2.3.3 閾值建立和結(jié)果判定:參照葛永超［1］方法進(jìn)行。對照組20例標(biāo)本，按上述方法進(jìn)行FISH實驗，每份標(biāo)本每個探針組合計數(shù)100個膀胱上皮細(xì)胞，統(tǒng)計出現(xiàn)不同類型異常情況細(xì)胞數(shù)目、正常細(xì)胞數(shù)目的百分比，建立參考閾值，閾值=平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。檢測指標(biāo)大于閾值，判定該指標(biāo)陽性，小于閾值判定該指標(biāo)陰性，等于閾值應(yīng)加大樣本細(xì)胞計數(shù)以確定最后結(jié)果。兩種或兩種以上染色體出現(xiàn)異?；蛲蝗旧w出現(xiàn)出現(xiàn)兩種以上異常，提示膀胱癌細(xì)胞的存在。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

本組49例患者，隨訪3～36個月，平均25.9個月。確診為膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)患者31例(63.3%)。尿液細(xì)胞學(xué)檢查、FISH技術(shù)檢測、膀胱鏡檢查均未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)患者18例(36.7%)。31例復(fù)發(fā)患者中，尿細(xì)胞學(xué)檢測12例為陽性(敏感性為38.7%)，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測26例陽性(敏感性為83.9%)，敏感性明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查見表1。所有FISH技術(shù)和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤患者均經(jīng)膀胱鏡檢查和病理診斷證實膀胱癌復(fù)發(fā)，故FISH技術(shù)和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的特異性均為100%。FISH技術(shù)檢測陽性的患者中，G3級腫瘤12例，G2級腫瘤8例，G1級腫瘤6例;尿液細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)G3級腫瘤8例，G2級腫瘤4例，無G1級腫瘤陽性病例。

表1 尿細(xì)胞學(xué)及FISH組檢測膀胱癌敏感性比較

3 討論

目前，膀胱鏡和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查是最常用的兩種檢測膀胱癌的手段。然而，膀胱鏡是一種有創(chuàng)檢查，給病人帶來一定的痛苦，而且膀胱鏡檢查的假陰性率為10%～30%［2］，傳統(tǒng)的尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測雖然具有比較高的特異性，但是細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性卻很低，尤其對低級別尿路上皮癌的檢測其敏感性更差。因此，為了更好地預(yù)測患者復(fù)發(fā)和病程進(jìn)展的風(fēng)險程度，更早地檢測腫瘤復(fù)發(fā)，需要敏感性更強的輔助檢測方法。近年來的分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)9號染色體的部分或全部丟失與膀胱癌的早期發(fā)生密切相關(guān);3、7、l 7號染色體的非整倍性與膀胱癌的發(fā)展密切相關(guān)。臨床研究顯示，對尿液中脫落細(xì)胞進(jìn)行以上遺傳學(xué)改變的檢測對膀胱癌的早期診斷及預(yù)后評估具有重要意義，尤其對早期尿路上皮癌患者有輔助診斷作用，其敏感性高于細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測，特異性則與細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查相當(dāng)［1，3］。

目前，針對以上所述的遺傳學(xué)改變而建立的檢測方法，即FISH技術(shù)，逐漸被歐美國家用于膀胱尿路上皮癌的早期診斷及術(shù)后監(jiān)測。目前，F(xiàn)ISH技術(shù)已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床膀胱癌早期檢測及預(yù)后監(jiān)測。Kipp［4］采用該方法監(jiān)測膀胱癌的復(fù)發(fā)，37例表淺性膀胱癌接受BCG膀胱內(nèi)灌注后，12例FISH結(jié)果陽性的患者均有腫瘤復(fù)發(fā)，認(rèn)為多色FISH可作為監(jiān)測膀胱癌腔內(nèi)灌注治療后復(fù)發(fā)的一種有效方法。Fdedrich［5］比較了多色FISH、BTA stat、NMP22等方法，認(rèn)為三者敏感性相似，但特異性上多色FISH明顯高于其他兩種方法，且不受血尿、尿路感染及膀胱內(nèi)灌注等影響。本組復(fù)發(fā)的膀胱癌患者敏感性為83.9%，而尿細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性為38.7%，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測膀胱癌與尿細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

FISH的一個重要特征是在膀胱鏡診斷膀胱癌復(fù)發(fā)之前已檢測出陽性結(jié)果。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ISH陽性常較膀胱鏡出現(xiàn)異常提前平均約6個月［6］。Zell-weger等［7］報道FISH檢查陽性組患者在中位為20.4個月的隨訪時間內(nèi)出現(xiàn)膀胱癌復(fù)發(fā)的發(fā)生率是39%，而FISH檢查陰性組復(fù)發(fā)率是21%。Sarosdy等［6］報道了36例膀胱鏡檢查陰性而FISH陽性者，在隨訪3～16個月(平均6個月)有15例(42%)確診為膀胱癌，而68例膀胱鏡檢查陰性、FISH陰性在隨訪3～19個月(平均11.2個月)只有13例(19%)確診為膀胱癌。于是Sarosdy提出一個術(shù)語“預(yù)期陽性”來反映一個事實，即FISH能在膀胱鏡發(fā)現(xiàn)可見腫瘤之前發(fā)現(xiàn)幾乎一半復(fù)發(fā)膀胱癌。Yoder等［8］隨訪了250例膀胱癌術(shù)后患者，發(fā)現(xiàn)211例膀胱鏡陰性的患者中，有56例FISH陽性，即約27%的患者出現(xiàn)預(yù)測陽性，其中35例(62.5%)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。本組患者在FISH檢測陽性后的6～24個月均出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，預(yù)測陽性率達(dá)到100%，較國外觀察結(jié)果高，可能是由于觀察病例少，病例偶然過于集中有關(guān)。但是，F(xiàn)ISH技術(shù)對于監(jiān)測膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的敏感性達(dá)到83.8%，較尿細(xì)胞學(xué)檢查高，是膀胱癌復(fù)發(fā)的有效檢測方法。

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