新牧一號苜蓿MvP5CS基因的克隆和功能分析

張 樺,張富春,曾 光,張 博,陳全家

(1.新疆草地資源與生態(tài)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆生物資源基因工程重點實驗室 新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046；3.新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

脯氨酸是植物在逆境中主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，研究表明，在脅迫條件下，脯氨酸不僅是生物大分子的保護劑或羥基的清除劑，還是植物從逆境脅迫條件中恢復正常過程中迅速、有效的氮源、碳源和還原劑[1]。生物體內(nèi)，由谷氨酸經(jīng)過兩步連續(xù)的還原后合成脯氨酸,Δ1-二氫吡咯-5-羧酸(P5C)為中間產(chǎn)物，催化該反應的酶為Δ1-二氫吡咯-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrrline-5-carboxylate synthetase,P5CS,EC2.7.2.11/1.2.1.41)。該酶是雙功能酶，具有γ-谷氨酰激酶和谷氨酰γ-半醛脫氫酶活性，催化從谷氨酸合成脯氨酸的最初兩步反應，其活性受脯氨酸反饋抑制[2]。目前已經(jīng)克隆了多種植物Δ′-吡咯琳-5-羧酸合成酶基因，不同植物的P5CS基因在干旱和鹽脅迫下表達量均上升[3-6]。說明P5CS基因的表達可以提高植物體內(nèi)脯氨酸的含量，從而減緩脅迫的危害。

苜蓿(Medicagosativa)是世界上分布范圍最廣、種植面積最大的多年生豆科牧草，在我國也是最重要的牧草之一。在鹽堿地同時種植苜蓿和啤酒大麥(Hordeumvulgare)，苜蓿的生物量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量均高于啤酒大麥，可改良鹽漬化土地。種植苜蓿不僅為動物帶來了營養(yǎng)豐富的食物，還使原本退化嚴重的天然草地變成了高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的苜蓿栽培草地，對恢復草地生態(tài)具有極其重要的推廣意義[7]。新牧一號苜蓿(M.variaXinmu-1)是從新疆天山中山帶野生黃花苜蓿(M.falcata)雜種群體中選育而成[8],于1987年育成并進行品種登記，登記號018。經(jīng)推廣后，目前在新疆各地廣泛種植。Wang等[9]對6種苜蓿的抗旱和抗鹽性進行分析，新牧一號雜花苜蓿在200 mmol·L-1鹽脅迫下發(fā)芽率仍為90%～95%，而其他苜蓿品種發(fā)芽率均低于新牧一號苜蓿。分析表明，新牧一號在鹽、PEG脅迫后超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)表達量都比敏鹽品種高。王玉祥等[10]綜合比較了新疆6個品種苜蓿在不同鹽脅迫處理下的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、株高、根長、可溶性糖含量和丙二醛含量，認為新牧一號抗逆性最強。但其耐鹽能力仍然有限，要在鹽堿地廣泛種植，必須進一步提高耐鹽能力。因為脯氨酸是植物在逆境下重要的滲透保護劑，與植物的抗逆性直接相關。本研究從克隆新牧一號苜蓿脯氨酸合成酶基因入手，研究新牧一號苜蓿P5CS基因的表達和作用，以期為進一步分析苜蓿的耐鹽分子機制和抗逆分子育種打下基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料 新牧一號苜蓿種子由新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)工程學院提供。

1.1.2試驗試劑 TRNzol 總RNA提取試劑，Taq DNA聚合酶試劑盒，凝膠回收試劑盒，DNA Marker購自天根生化科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑，pMD19-T載體試劑盒，SYBR Green Ⅰ熒光定量試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA提取和RT-PCR 新牧一號苜蓿種子室溫萌發(fā)10 d后，150 mmol·L-1NaCl處理過夜，稱取0.1 g葉片于液氮中研磨，參照天根生化科技有限公司的TRNzol試劑盒提取說明書步驟提取總RNA。使用天根公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物根據(jù)Genbank中紫花苜蓿相關基因設計序列為P3：ATGGCGAACGCCGACCCTTGTAG，P4：TCAAGTAGTTA GGTCTTTGTGGGTG。參照天根生化科技有限公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA第一鏈，所得cDNA用于PCR擴增。PCR擴增體系為cDNA 1 μL，dNTP mixture(10 mmol·L-1each)1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，Taq酶Buffer 2.5 μL，引物各1 μL，去離子水18 μL。PCR程序為94 ℃預變性3 min后，94 ℃變性1 min，47 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 30 s，進行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖電泳檢測后按天根生化凝膠回收試劑盒所述方法回收目的條帶。

1.2.2連接、轉(zhuǎn)化、篩選和序列分析 參考TaKaRa產(chǎn)品說明書取pMD19-T 0.5 μL加回收的插入片段4.5 μL，再加入5 μL solution I,16 ℃連接12 h后，全量加入100 μL DH5α感受態(tài)細胞中，冰上放置30 min，42 ℃加熱45 s后，在冰上放置1 min，加入890 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min，涂布于含有Amp的LB平板培養(yǎng)基上，37 ℃過夜，對菌落進行編號后挑菌落于1 mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)16 h，進行菌液PCR，PCR擴增體系為菌液1 μL，dNTP mixture(10 mmol·L-1each)1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，Taq酶Buffer 2.5 μL，T載體的m13引物各1 μL，去離子水18 μL。PCR程序為94 ℃預變性3 min后，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 30 s，進行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。電泳檢測后對陽性菌液提取質(zhì)粒DNA進行酶切分析，陽性克隆分別命名為pMD19-T-MvP5CS，將陽性克隆交上海生物工程技術服務有限公司測序，對測序結果進行序列分析。

1.2.3熒光定量PCR分析MvP5CS的表達 新牧一號苜蓿種子發(fā)芽10 d后,用150 mmol·L-1NaCl脅迫,分別在0、1、3、6、12和24 h時取0.1 g葉片，分別用TRNzol試劑提取總RNA，紫外分光光度法測含量以定量總RNA，分別反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設計熒光定量PCR引物，根據(jù)在Genbank登錄的苜蓿微管蛋白基因(EU664318STBZ)作為內(nèi)參基因，以此基因部分序列設計引物，長度153 bp，ACT1:CGAGCGTGGATACTCTTTC，ACT2:CCATCAGGCAACTCATAGC；根據(jù)已測序的MvP5CS基因序列設計引物，MvP5CS特異引物長度262 bp，P5RT1:CTTGGCAATACGAAGTGGGA，P5RT2:AGCATGACCTAGAACAGGGA。

SYBR Green I實時熒光定量PCR 20 μL反應體系：ddH2O 7.2 μL，上下游引物各0.4 μL(10 μmol),SYBR primeEx Tag，上述cDNA樣本1 μL。稀釋cDNA成6個梯度,得到不同濃度的標準模板10～106，進行靶基因MvNHX1及內(nèi)參基因actin的SYBR Green Ⅰ實時定量PCR反應,反應體系加入毛細管后使用LightCycler 2.0儀器進行PCR擴增。反應條件為95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s。設置溫度改變速率均為20 ℃·s-1，循環(huán)45次。制備標準曲線并檢測擴增效率。做溶解曲線分析是否為特異性擴增，程序為95 ℃ 0 s 20 ℃·s-1;65 ℃ 15 s 20 ℃·s-1;95 ℃ 0 s 0.1 ℃·s-1。以苜蓿actin基因為參照基因，檢測新牧一號苜蓿樣品中的MvP5CS基因的表達水平，以0 h樣本為校準樣本，1～24 h樣本為待測樣本，比較MvNHX1基因的表達差異，利用2-ΔΔCt進行相對定量分析，結果繪制成柱狀圖。

ΔCt0 h=0 hMvNHX1基因Ct值-actin基因Ct值；

ΔCt待測樣本=待測樣本MvNHX1基因Ct值-actin基因Ct值；

ΔΔCt=ΔCt待測樣本-ΔCt0 h；

2-ΔΔCt=2-(ΔCt待測樣本-ΔCt0 h)。

1.2.4植物表達載體pCAMBIA2300-MvP5CS構建 在MvP5CS上游引物加BamHI位點，下游引物加PstI位點，設計引物，mqP5CS1：CGGGATCCATGGCGAACGCCGACCCTTGTAG，mqP5CS2：GGCTGCAGTCAAGTAGTTAGGTCTTTGTGGGT。用此引物對pMD19-T-mvP5CS進行PCR后回收產(chǎn)物，用BamHI和PstI雙酶切后與同樣雙酶切的植物表達載體pCAMBIA2300-35S連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆。連接轉(zhuǎn)化篩選方法同1.3.2，將陽性載體分別命名pCAMBIA2300-MvP5CS。將陽性克隆交上海生物工程技術服務有限公司測序，對測序結果進行序列分析。

1.2.5MvP5CS基因轉(zhuǎn)煙草功能的初步驗證 將經(jīng)過鑒定的植物表達載體pCAMBIA2300-MvP5CS用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。再用葉盤方法轉(zhuǎn)化煙草[11-14]，經(jīng)過煙草葉片預培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，待幼苗長出根系后，將苗移至盛有無菌土的花盆中。

獲得T0代轉(zhuǎn)基因煙草，并提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因組DNA，進行PCR 檢測。用MvP5CS基因特異中間片段引物MvP5CS-P3：ATGGCGAACGCCGACCCTTGTAG，MvP5CS-P4：ACTGACTGCGTCGTTCTCGT；nptⅡ上游引物：5′-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3′，nptⅡ下游引物：5′-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3′，來檢查目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達情況。反應條件：94 ℃預變性3 min后，94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進行35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.2.6轉(zhuǎn)基因煙草T1代的耐鹽性分析 將轉(zhuǎn)基因煙草T1代和非轉(zhuǎn)基因煙草分別播種于含有0、100、150、200、250和300 mmol·L-1NaCl的平皿中，每皿放兩層濾紙，50粒種子，觀察種子的萌發(fā)情況，7 d后觀察并記錄試驗結果。試驗分析獲得的所有結果都在同樣的條件下重復3次，每次50粒。測定結果用SPSS 15.0進行方差分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準偏差表示。

2 結果

2.1MvP5CS的克隆 通過RT-PCR擴增,在新牧一號苜蓿葉片cDNA中擴增出1條大小為2 100 bp左右的DNA片段,大小與預測相符(圖1)。

圖1 MvP5CS基因RT-PCR擴增結果

將該片段回收后與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化，PCR和雙酶切篩選陽性克隆，將陽性克隆命名為pMD19-T-MvP5CS(圖2)。雙酶切片段與RT-PCR片段大小一致。

圖2 重組質(zhì)粒pMD19-T- MvP5CS的酶切鑒定

2.2MvP5CS的序列分析 序列分析表明(圖3)，MvP5CS全長2 148 bp，編碼715個氨基酸。用DNAMAN軟件對本研究所得序列與GenBank中登記的一些物種P5CS氨基酸序列的相似度進行比較,MvP5CS氨基酸序列與紫花苜蓿MsP5CS(X98421)相似度為94.41%，與大豆(Glycinemax)GmP5CS(AY492005)相似度為89.93%，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtP5CS(NM201912)相似度為63.88%，與水稻(Oryzasativa)OsP5CS(AY574031)相似度為75.56%，與蕃茄(Solanumlycopersicum)SlP5CS(U60267)相似度為76.71%。氨基酸序列比對顯示，MvP5CS蛋白都包含有高等植物P5CS蛋白質(zhì)的6個主要功能域：ATP結合位點，2個亮氨酸結構域，NADPH結合位點，谷氨酰激酶(GK)結構域和谷氨酸半醛(GSA)結構域，說明MvP5CS蛋白在新牧一號雜花苜蓿脯氨酸合成中起作用。從圖3可以看到，除谷氨酰激酶(GK)結構域和1個亮氨酸結構域差異較大外，其他4個功能域的差異都較小，說明P5CS蛋白質(zhì)的主要功能域相對保守。在MvP5CS的128位點發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸，說明MvP5CS和其他已發(fā)現(xiàn)的P5CS酶一樣，其活性可能被高濃度脯氨酸抑制。同時，新牧一號雜花苜蓿MvP5CS與紫花苜蓿MsP5CS相比，有37個氨基酸的缺失，這是否與脯氨酸的合成量有關，還需進一步研究。

圖3 MvP5CS氨基酸序列與其他植物P5CS氨基酸序列的比較分析

2.3熒光定量PCR分析MvP5CS的表達 在RT-PCR擴增后進行熔解曲線分析(圖4)。從熔解曲線看出，目標基因MvP5CS和參照基因actin的PCR擴增產(chǎn)物分別在82.5和83.5 ℃達到峰值，無非特異產(chǎn)物和引物二聚體，整個試驗過程沒有污染，目標基因和參照基因表達穩(wěn)定。

圖4 MvP5CS基因和actin熔解曲線

以苜蓿actin基因為對照基因，特異性引物進行熒光定量PCR分析MvP5CS基因鹽脅迫下的表達，采用的是相對定量2-ΔΔCt法計算MvP5CS鹽脅迫下的表達。結果顯示(圖5)，MvP5CS在鹽脅迫后表達上調(diào)，12 h前表達量上升不明顯，到24 h呈顯著上升趨勢，是脅迫前的31倍，說明苜蓿應對滲透脅迫時其可溶性滲透物質(zhì)脯氨酸大量累積，使得在受到脅迫時有效地減輕脅迫，以維持細胞正常的膨壓，增強苜蓿的抗逆性。

2.4植物表達載體構建 pCAMBIA2300-MvP5CS經(jīng)BamHI和PstI雙酶切后得到2 100 bp左右的片段，與實際大小一致(圖6)，表明pCAMBIA2300-MvP5CS植物表達載體構建成功。

2.5MvP5CS基因轉(zhuǎn)煙草PCR檢測 用nptⅡ基因引物和特異引物對轉(zhuǎn)基因煙草T0代總DNA進行PCR擴增，同時以非轉(zhuǎn)基因煙草作為對照。用nptⅡ基因引物檢驗MvP5CS基因煙草20棵，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草有16棵檢測到了特異性條帶，轉(zhuǎn)化率80%(圖7)。為證明以上獲得的轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株是抗卡那霉素的陽性煙草植株，又用MvP5CS基因設計引物擴增特異中間片段對已篩選的抗性植株進行PCR檢測，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草有15棵檢測到了特異條帶(圖8)，以上結果初步證明外源基因已經(jīng)整合到了煙草植株的基因組中。

圖5 MvP5CS基因在鹽脅迫后不同時間的表達

圖6 pCAMBIA2300-MvP5CS酶切圖譜

圖7 轉(zhuǎn)基因煙草T0代的nptⅡ基因PCR鑒定

2.6轉(zhuǎn)基因煙草T1代的耐鹽性分析 在無鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草T1代植株的長勢與非轉(zhuǎn)基因煙草植株的長勢沒有較大差異，而在不同濃度鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草T1代植株仍能正常生長，且轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株的長勢明顯好于非轉(zhuǎn)基因煙草植株，根長和生物量也明顯高于非轉(zhuǎn)基因煙草植株(圖9)。

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草T0代基因中間片段的PCR鑒定

圖9 不同濃度NaCl脅迫對煙草種子萌發(fā)的影響

正常條件下，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草T1代植株的萌發(fā)率與非轉(zhuǎn)基因煙草植株的萌發(fā)率基本相同，而在不同濃度NaCl脅迫條件下，轉(zhuǎn)MvP5CS基因煙草T1代植株的萌發(fā)率都顯著高于非轉(zhuǎn)基因煙草植株(圖10)。方差分析表明，轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下萌發(fā)率存在顯著差異(P<0.05),說明轉(zhuǎn)MvP5CS基因提高了煙草的耐鹽性。

3 討論

在脅迫條件下，植物中的脯氨酸積累是兩條途徑相互調(diào)控的結果，既增加了脯氨酸合成酶基因的表達量，同時又抑制了脯氨酸降解酶的活性，最終導致脯氨酸含量的增加，從而提高對脅迫的抗性[15]。已有研究表明，在一定的脅迫范圍內(nèi)，植物可通過自身細胞的滲透調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)出對外界滲透脅迫的抵抗能力。在滲透脅迫下，植物體內(nèi)會積累很多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以維持細胞正常的膨壓，增強植物的抗逆性。本試驗從新牧一號苜蓿中克隆出MvP5CS基因，通過熒光定量PCR分析在鹽脅迫下0～24 h的MvP5CS基因表達情況。結果顯示，MvP5CS基因在鹽脅迫后表達均上調(diào)，到24 h時，MvP5CS在鹽脅迫下表達量是未脅迫時的31倍，P5CS酶是脯氨酸合成的關鍵酶，脅迫后大量表達說明苜蓿響應滲透脅迫時其脯氨酸大量累積可有效地減輕脅迫。將MvP5CS轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性得到提高，進一步證明該基因與耐鹽性有關。

圖10 不同濃度NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因煙草種子的發(fā)芽率

劉旻霞和馬建祖[16]以甘南亞高山草甸植物為研究樣本，分析了不同環(huán)境梯度條件下的6種植物葉片內(nèi)脯氨酸含量，發(fā)現(xiàn)隨著從陰坡、半陰半陽坡、陽坡環(huán)境的變化，脯氨酸含量都有不同程度的增加；而且植物品種的不同，脯氨酸含量的增加幅度有差異，進一步可以認為葉片內(nèi)脯氨酸含量的高低可作為衡量植物抗逆性的指標。研究表明[17-19]，轉(zhuǎn)P5CS基因植物的脯氨酸含量均高于對照組，同時轉(zhuǎn)P5CS基因植物的耐鹽和抗旱性都明顯提高。綜上所述，將外源P5CS基因轉(zhuǎn)入植物中可以提高轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量，可以部分改善轉(zhuǎn)基因植物抗脅迫的能力，尤其是耐鹽、抗旱方面的能力。與農(nóng)作物相比，牧草大多種植在生長條件相對惡劣的環(huán)境下，因此，培育具有某一或多個抗逆性的牧草品種，對改良牧草特性和擴大種植面積具有重要作用[20]。

MvP5CS基因的獲得為進一步研究新牧一號苜?？鼓婢趁{迫的機制提供了理論依據(jù)，也為后續(xù)試驗奠定了基礎。因為脯氨酸的大量合成在抗逆反應中起主要作用，但大量的脯氨酸會反饋抑制P5CS酶的活性，下一步可以通過定點突變法，將MvP5CS中127位的苯丙氨酸突變?yōu)槠渌被?，這樣可以阻止脯氨酸的反饋抑制，從而得到更多的脯氨酸積累以應對脅迫。同時，該研究成果也可推廣到其他植物，為轉(zhuǎn)基因分子育種提高牧草和作物的抗逆性提供優(yōu)越的基因資源。

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