綠葉汁發(fā)酵液為添加劑改善玉米青貯品質(zhì)的研究

嚴(yán) 萍，張永輝，麥熱姆妮薩·艾麥爾，阿不都克尤木·買(mǎi)買(mǎi)提，烏斯?jié)M·依米提

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830046)

青貯是以新鮮的青飼料為原料，在密閉條件下，利用植物表面自然附生的乳酸菌，通過(guò)厭氧發(fā)酵，將植物表面的可溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸等有機(jī)酸，使飼料pH值降低，來(lái)抑制霉菌、酵母菌、梭狀芽孢桿菌等腐敗微生物的生長(zhǎng)繁殖，通過(guò)青貯可以達(dá)到保持青飼料營(yíng)養(yǎng)特性的目的[1-2]。傳統(tǒng)青貯方法以粗鹽為添加劑，采用這種方法制得的青貯飼料品質(zhì)不佳。

改善青貯發(fā)酵品質(zhì)方面所利用的添加劑種類(lèi)較多。目前在各國(guó)普遍采用的添加劑有甲酸、乳酸菌制劑和乳酸菌制劑與酶制劑的混合物等。通常認(rèn)為促進(jìn)青貯發(fā)酵的乳酸菌為原料上附著的野生乳酸菌，數(shù)量很少，尤其在青貯發(fā)酵過(guò)程中起重要作用的乳酸桿菌數(shù)量極少[3]。綠葉汁發(fā)酵液是通過(guò)發(fā)酵，大量增殖原料表面附著的野生乳酸菌，從而使青貯發(fā)酵效果更好[4-6]。

新疆是我國(guó)最大的牧區(qū)之一，冬季漫長(zhǎng)，草地沙漠化嚴(yán)重。草地的沙漠化及飼料的季節(jié)供應(yīng)不足制約著畜牧業(yè)的發(fā)展，青貯工藝可以在很大程度上改善這種制約。本研究采用綠葉汁發(fā)酵液作為青貯添加劑來(lái)制作青貯飼料，并測(cè)定其發(fā)酵品質(zhì)，就是建立在新疆特殊氣候條件下，可以極大改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和消化率的發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1材料 青貯原料為2009年10月采自新疆吐魯番地區(qū)的蠟熟期收獲的飼料玉米(Zeamays)(新疆飼料玉米一號(hào))；MRS固體培養(yǎng)基用于乳酸菌的計(jì)數(shù)；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于細(xì)菌的計(jì)數(shù)；馬丁氏培養(yǎng)基用于真菌的計(jì)數(shù)。

1.2儀器與設(shè)備 高壓滅菌鍋(上海博迅公司生產(chǎn))，GXZ型智能光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠生產(chǎn))，JD200-3 型電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子稱(chēng)量?jī)x器有限公司生產(chǎn))，SWCJ-1F 型超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn))，哈納酸度離子計(jì)pH211(北京哈納科儀科技有限公司生產(chǎn))，LC-20AD Prominence 島津高效液相色譜儀(島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司生產(chǎn))及凱氏定氮儀。

1.3綠葉汁發(fā)酵液的制備 稱(chēng)取新鮮飼料玉米樣品(經(jīng)過(guò)切割混勻，長(zhǎng)度約為2 cm)200 g，置于1 000 mL 2%的葡萄糖溶液中，每隔4 h測(cè)一次OD660 nm值，連續(xù)測(cè)48 h，繪制乳酸菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖，得到綠葉汁發(fā)酵液菌落穩(wěn)定期時(shí)間，重復(fù)稱(chēng)取飼料玉米樣品200 g，置于1 000 mL 2%葡萄糖溶液中，待菌落達(dá)到穩(wěn)定期后，過(guò)濾備用。

1.4青貯飼料的制作 提前處理飼料樣品，長(zhǎng)度為2～5 cm。按表1的處理方式制作青貯飼料，裝于廣口塑料瓶中(裝填量要保證瓶中基本無(wú)空氣)。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)[7-8]。

表1 青貯飼料處理方式

1.5青貯飼料菌落分布 稱(chēng)取經(jīng)過(guò)切割混勻，長(zhǎng)度約為2 cm的青貯飼料樣品20 g ，置于裝有180 mL無(wú)菌水的三角瓶中，震蕩30 min后，吸取菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫?0-4、10-5、10-63個(gè)稀釋度。在細(xì)菌培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基上涂布。30 ℃培養(yǎng)48 h后，用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[9]。

1.6青貯飼料品質(zhì)鑒定 采用烘干法測(cè)定干物質(zhì)(DM)，即真空干燥箱105 ℃恒溫干燥，稱(chēng)量；稱(chēng)取青貯飼料50 g，加450 mL蒸餾水粉碎后，經(jīng)8層紗布過(guò)濾，用哈納酸度離子計(jì)測(cè)定濾液pH值；采用范式洗滌纖維法測(cè)定中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)；采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白(CP)含量[10]。揮發(fā)性脂肪酸采用高效液相色譜法測(cè)定[11-15]；消化率采用模擬瘤胃消化試驗(yàn)法測(cè)定，模擬飼料在瘤胃和皺胃中的消化。采集成年健康羊的胃液，經(jīng)澄清過(guò)濾后，與緩沖液(緩沖液配方為碳酸氫鈉 9.8 g·L-1、磷酸氫二鈉9.3 g·L-1、氯化鈉0.47 g·L-1、氯化鉀0.57 g·L-1、尿素1 g·L-1、氯化鈣0.04 g·L-1、氯化鎂0.06 g·L-1)以1∶1的體積比混勻(混合前，緩沖液在38 ℃下預(yù)熱)。稱(chēng)取干燥粉碎樣品(過(guò)40目)2.000 g放入消化瓶中，在38 ℃下預(yù)熱。向消化瓶中加入50 mL配好的消化液，搖動(dòng)混合，通入氮?dú)?。密封，將消化瓶放?8 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每6 h測(cè)一次產(chǎn)氣量。測(cè)定其干物質(zhì)、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維及粗蛋白消化率[15-17]。

1.7統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1青貯原料的化學(xué)成分及微生物數(shù)量 青貯前先對(duì)青貯原料的化學(xué)成分微生物數(shù)量進(jìn)行分析，干物質(zhì)含量72%，pH值7.6，CP、NDF、ADF和ADL含量分別為13.5%、52%、27%和24%，乳酸菌、細(xì)菌和真菌數(shù)量分別為3.6×103、7.5×107和1.4×107cfu·g-1。

2.2綠葉汁發(fā)酵液中乳酸菌生長(zhǎng)曲線(xiàn) 青飼料在碳源(葡萄糖)充足的狀態(tài)下，乳酸菌經(jīng)過(guò)24 h達(dá)到穩(wěn)定期，經(jīng)菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定，綠葉汁發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量達(dá)到2.49×107cfu·mL-1(圖1)。取此時(shí)的綠葉汁發(fā)酵液作添加劑菌體量最大，可以達(dá)到最好的效果。

2.3青貯飼料菌落分布 飼料經(jīng)過(guò)青貯后乳酸菌數(shù)量明顯增加，由原料中3.6×103cfu·g-1增加為(2.53×105～3.47×106)cfu·g-1，而細(xì)菌和真菌的數(shù)量都減少了2個(gè)數(shù)量級(jí)(表2)。說(shuō)明青貯后，乳酸菌大量繁殖，產(chǎn)生較多乳酸，從而抑制了細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)繁殖。添加綠葉汁發(fā)酵液后，乳酸菌菌落數(shù)較對(duì)照組及傳統(tǒng)方法組多一個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明添加綠葉汁發(fā)酵液可以增加乳酸菌菌落數(shù)，更有利于青貯過(guò)程的進(jìn)行。

表2 青貯飼料菌落分布

2.4青貯飼料品質(zhì)分析結(jié)果 經(jīng)過(guò)青貯后，飼料pH值均由7.6降為5.0以下，處理組pH值均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；添加綠葉汁發(fā)酵液與傳統(tǒng)加鹽方法相比pH值也顯著降低(表3)。除添加1.0%發(fā)酵液3% NaCl處理外，其他處理組乳酸含量均顯著高于對(duì)照組，且添加1.5%和2.0%綠葉汁發(fā)酵液的青貯飼料乳酸含量顯著高于傳統(tǒng)加鹽組。傳統(tǒng)加鹽組、添加1.0%發(fā)酵液與對(duì)照組乙酸含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，添加1.5%和2.0%綠葉汁發(fā)酵液組顯著高于與對(duì)照組和傳統(tǒng)加鹽組。除添加1.0%發(fā)酵液和3% NaCl處理組外，其余處理組總酸含量均顯著高于對(duì)照組，且添加1.5%和2.0%綠葉汁發(fā)酵液組顯著高于傳統(tǒng)加鹽組(表3)。

2.5青貯飼料化學(xué)成分 經(jīng)過(guò)青貯后，飼料干物質(zhì)量、CP含量有所增加。發(fā)酵液處理組干物質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組與加鹽組(P<0.05);加鹽組干物質(zhì)含量均與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；1.0%發(fā)酵液處理組CP含量顯著高于對(duì)照組，3% NaCl組顯著低于對(duì)照組，其余各組與對(duì)照無(wú)顯著差異，各發(fā)酵液組的ADF含量及NDF含量與對(duì)照組相比，顯著低于對(duì)照組；添加1.5%、2.0%發(fā)酵液處理組NDF含量顯著低于對(duì)照；除2.0%發(fā)酵液和1% NaCl處理組ADL含量顯著低于對(duì)照組外，其余各處理組均與對(duì)照組無(wú)顯著差異(表4)。

2.6體外消化率結(jié)果 除3% NaCl處理組外，其他處理組NDF、ADF消化率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；1.5%發(fā)酵液及1% NaCl處理組的CP消化率顯著高于對(duì)照組，1.0%發(fā)酵液、2.0%發(fā)酵液、3% NaCl差異不顯著(P>0.05)；處理組干物質(zhì)消化率高于對(duì)照組，1.0%發(fā)酵液、1.5%發(fā)酵液、1% NaCl、3% NaCl與對(duì)照組相比差異不顯著(表5)。

表3 不同青貯處理對(duì)飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

表4 不同青貯處理對(duì)飼料化學(xué)成分的影響

表5 不同青貯處理對(duì)體外消化率的影響

3 討論

新疆畜牧業(yè)發(fā)展的總體目標(biāo)是大力發(fā)展牛、羊等草食家畜，逐步形成一個(gè)“節(jié)糧型” 畜牧業(yè)結(jié)構(gòu)。從我國(guó)農(nóng)業(yè)整體發(fā)展戰(zhàn)略考慮，發(fā)展草食家畜主要依靠農(nóng)區(qū)，飼用玉米種植面積在近10年內(nèi)將會(huì)發(fā)展到全疆玉米種植面積的15%～20%[18]。飼料玉米具有高產(chǎn)、多汁清香，適口性好、纖維素含量低、利于消化等優(yōu)點(diǎn)。但飼料玉米碳水化合物含量較少，未能滿(mǎn)足優(yōu)質(zhì)青貯飼料所需的8%～10%含量[19],本研究通過(guò)添加葡萄糖來(lái)提高碳水化合物含量，以保證青貯過(guò)程順利進(jìn)行。一般情況下，植物體表面附著乳酸菌數(shù)量不足，主要是異型發(fā)酵乳酸菌，同時(shí)包括大量不良菌種(霉菌、酵母菌和丁酸菌)。若乳酸菌數(shù)量不足，青貯初期乳酸菌繁殖緩慢，不能有效抑制有害微生物增殖，要使乳酸菌快速繁殖并占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，理論上要求每克青貯飼料上附著的乳酸菌菌落數(shù)必需在105個(gè)以上[20]。本研究通過(guò)添加綠葉汁發(fā)酵液使乳酸菌數(shù)量達(dá)到要求數(shù)量，保證青貯初期發(fā)酵所需足夠的乳酸菌數(shù)量，通過(guò)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸降低pH值，抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，保持青飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

徐慶方等[21]研究結(jié)果表明，添加綠葉汁發(fā)酵液青貯后，pH值降低至4.32以下，乳酸含量增加至6.26%。經(jīng)品質(zhì)測(cè)定結(jié)果可知，在添加綠葉汁發(fā)酵液及葡萄糖后，青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)比對(duì)照組及傳統(tǒng)青貯方法組有明顯改善，pH值降低至4.0以下，乳酸、乙酸含量增加，特別是添加2.0%乳酸菌發(fā)酵液組pH值低于3.5以下。有害菌數(shù)量減少，乳酸菌數(shù)量增加至3.47×106cfu·g-1，干物質(zhì)含量、粗蛋白含量以及有機(jī)酸含量都有較大程度的提高。

通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果初步確定了綠葉汁發(fā)酵液的最佳添加濃度，同時(shí)進(jìn)一步了解到綠葉汁發(fā)酵液可以提高青貯飼料干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維素及酸性洗滌纖維素消化率，比起傳統(tǒng)青貯方法，添加綠葉汁發(fā)酵液可以改善青貯品質(zhì)，抑制有害微生物的繁殖，減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失，提高干物質(zhì)，粗蛋白和纖維素的消化率，從而提高青貯飼料利用率，緩解飼料季節(jié)性供應(yīng)不足的問(wèn)題。本研究為生產(chǎn)高品質(zhì)青貯飼料技術(shù)提供一定的理論和科學(xué)依據(jù)。

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