MAP30基因轉(zhuǎn)化煙草的研究

欒 杰，陳秀玲，侯莉華，李小梅，王傲雪*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.大慶市教師進(jìn)修學(xué)院，黑龍江 大慶 163311）

MAP30是從苦瓜果實(shí)和種子中分離純化得到的一種單鏈、I型核糖體失活蛋白，其分子質(zhì)量為30 ku[1]。MAP30不但具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種生物學(xué)活性，而且它還具有特異性，只對病毒感染的細(xì)胞有效，對正常細(xì)胞無毒副作用[2]。MAP30這些獨(dú)特的優(yōu)勢，使其具有成為抗腫瘤、抗病毒的治療藥物的可能性[3-6]。煙草是基因工程生產(chǎn)的模式植物，其葉片中富含蛋白質(zhì)，一般為15%，可高達(dá)20%，蛋白質(zhì)提取后呈結(jié)狀，無異味，水溶性好。研究表明，煙草懸浮細(xì)胞通常是人們首選培養(yǎng)細(xì)胞，由于植物細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)環(huán)境可以人為控制、下游純化較為方便，因此比較適于生產(chǎn)藥用蛋白，具有開發(fā)利用的廣闊前景。

本研究以煙草葉片為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將MAP30基因?qū)霟煵莼蚪M中，以煙草為生物反應(yīng)器為生產(chǎn)MAP30藥用蛋白提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草BY2種子、植物表達(dá)載體pBIMAP30質(zhì)粒及農(nóng)桿菌EHA105菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶（Bam HⅠ、SacⅠ）、pfu酶購自TaKaRa公司；卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）購自Bio BASIC公司；標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Trans2K購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

YEP培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g，蒸餾水定容到1000 mL，NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，固體培養(yǎng)基含0.8%瓊脂。M1：MS基本培養(yǎng)基；2%MSO菌液重懸培養(yǎng)基：MS粉4.3 g、肌醇100 mg、VB1（1 mg·mL-1）0.4 mL、蔗糖20 g，蒸餾水定容至1000 mL；M2：預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)培養(yǎng)基，MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA；M3：分化及篩選培養(yǎng)基，MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IAA+500 mg·L-1Cef；M4：生根培養(yǎng)基，1/2 MS+500 mg·L-1Cef，pH 5.8[7]，固體培養(yǎng)基均含0.8%瓊脂，培養(yǎng)基均121℃、高溫、高壓滅菌20 min。

1.2.2 煙草無菌苗的制備

將煙草種子用70%酒精沖洗30 s，無菌水沖洗3～4次后，在含有10%的NaClO溶液中滅菌10 min，再用無菌水沖洗3～4次，將種子擺在M1培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)苗長出4～5片真葉時進(jìn)行轉(zhuǎn)化[8]。

1.2.3 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

通過凍融法將植物表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，在含有50 mg·L-1Kan、50 mg·L-1Rif的培養(yǎng)基上培養(yǎng)48～96 h至有單菌落長出，提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒，以兩條特異引物1ST-S：5'AAGGATCC ACCATGGTGGTATGCTTACTAC 3'；1ST-A：5'AT TCACAACAGATTCCCC 3'進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、54℃退火20 s、72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。質(zhì)粒用Bam HⅠ、SacⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.4 侵染菌液的制備

挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含有50 mg·L-1Kan和50 mg·L-1Rif的10 mL YEP液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r·min-1過夜震蕩培養(yǎng)至OD600為0.5左右；按1∶10的比例將菌液轉(zhuǎn)接入50 mL YEP培養(yǎng)基中進(jìn)行二次活化，200 r·min-1，28℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD600約0.5；菌液在4 ℃、10000 r·min-1條件下離心10 min，菌體用50 mL 2%的MSO培養(yǎng)基重新懸??；使菌液OD600=0.5準(zhǔn)備用于侵染。

1.2.5 選擇培養(yǎng)中Kan選擇壓的確定

本試驗(yàn)共設(shè)置0、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mg·L-1Kan 11個水平，分別于15、30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率及芽誘導(dǎo)率。

1.2.6 煙草遺傳轉(zhuǎn)化

1.2.6.1 預(yù)培養(yǎng)時間對煙草葉片轉(zhuǎn)化的影響

煙草葉片切成0.5 cm2接種在M2培養(yǎng)基上，設(shè)6個時間梯度：0、12、24、36、48、72 h，每個處理60個外植體。

1.2.6.2 共培養(yǎng)時間對煙草葉片轉(zhuǎn)化的影響

各處理外植體用2%MSO培養(yǎng)基重懸菌液侵染20 min后接種于M2培養(yǎng)基，共培養(yǎng)時間設(shè)為：0、12、24、48、72、96 h，然后轉(zhuǎn)入M3培養(yǎng)基培養(yǎng)，30 d后觀察子葉不定芽分化情況。

1.2.6.3 轉(zhuǎn)化煙草外植體再生成植株將長至2～4 cm不定芽切下，轉(zhuǎn)入M4上誘導(dǎo)生根。苗長至4 cm左右時，揭開封口膜，在室內(nèi)煉苗2 d，栽于溫室培養(yǎng)。

1.2.7 抗性植株的檢測

1.2.7.1 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測

取7株轉(zhuǎn)化抗性植株與1株未轉(zhuǎn)化植株，采用CTAB法提取植物基因組DNA，檢測MAP30基因是否已經(jīng)整合到煙草基因組中。

1.2.7.2 轉(zhuǎn)化植株的RT-PCR分析

采用Trizol法提取PCR擴(kuò)增呈陽性轉(zhuǎn)化植株葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR及酶切鑒定

從圖1可以看出，經(jīng)PCR擴(kuò)增出867 bp大小的條帶，鑒定其為陽性質(zhì)粒。將能正確擴(kuò)增的質(zhì)粒進(jìn)行Bam HⅠ，SacⅠ雙酶切，結(jié)果與預(yù)期片斷大小相同，如圖2所示。

圖1 EHA105單菌落的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of EHA105 single clone

圖2 pBIMAP30的雙酶切電泳圖譜Fig.2 Digestion products of pBIMAP30 by enzyme Bam H I and Sac I

2.2 選擇培養(yǎng)中Kan選擇壓的確定

研究表明，隨著Kan濃度增加，愈傷組織誘導(dǎo)率和芽誘導(dǎo)率隨之降低，當(dāng)Kan濃度為90 mg·L-1時，愈傷組織誘導(dǎo)率和芽誘導(dǎo)率都較低，當(dāng)其濃度達(dá)到100 mg·L-1時，葉片分化完全受抑制。所以本試驗(yàn)選擇Kan濃度為100 mg·L-1，如圖3所示。

圖3 不同Kan濃度對煙草愈傷組織誘導(dǎo)率和芽誘導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect on of different Kan concentrations on the rate of tobacco callus and bud

2.3 預(yù)培養(yǎng)時間對煙草葉片轉(zhuǎn)化和再生的影響

由表1可知，預(yù)培養(yǎng)時間較長或較短均不利于轉(zhuǎn)化及再生。36 h預(yù)培養(yǎng)時，抗性愈傷組織和抗性芽形成最多，愈傷組織誘導(dǎo)率為76.4%，芽誘導(dǎo)率74.5%。因此，以36 h預(yù)培養(yǎng)為宜。

表1 預(yù)培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響Table 1 Effect of pre-culture time on transformation

2.4 共培養(yǎng)時間對煙草葉片再生及轉(zhuǎn)化的影響

結(jié)果見表2。

表2 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響Table 2 Effect of different co-culture time on transformation

從表2可以看出，48 h共培養(yǎng)對外植體愈傷組織誘導(dǎo)率和芽誘導(dǎo)率都較高。

2.5 抗性轉(zhuǎn)化植株的獲得

通過農(nóng)桿菌侵染、Kan抗性篩選、誘導(dǎo)生根、移栽，獲得抗性煙草植株，如圖4所示。

圖4 煙草遺傳轉(zhuǎn)化過程Fig.4 Process of tobacco genetic transformation

2.6 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測

對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測，5株轉(zhuǎn)化煙草植株867 bp處均有電泳條帶，而對照無條帶。

如圖5所示，說明外源基因已經(jīng)整合到煙草基因組中。

圖5 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測Fig.5 PCR detection of transgenic tobacco plant

2.7 轉(zhuǎn)化植株的RT-PCR檢測

對5株P(guān)CR檢測呈陽性的植株，提取葉片總RNA進(jìn)行RT-PCR分析（見圖6）。

圖6 轉(zhuǎn)化植株的RT-PCR檢測Fig.6 RT-PCR detection of transgenic tobacco plant

如圖6所示，有2株煙草轉(zhuǎn)化植株RT-PCR呈陽性，說明MAP30基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，適合T-DNA轉(zhuǎn)移的反應(yīng)條件和感受細(xì)胞的形成是成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵[9]。選擇適宜的預(yù)培養(yǎng)時間能使傷口部分愈合，使其對農(nóng)桿菌侵染耐受性增強(qiáng)。預(yù)培養(yǎng)時間過長，傷口愈合部分增多，農(nóng)桿菌侵染的困難增加，外源基因不易導(dǎo)入。T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞是在共培養(yǎng)這個階段完成的，共培養(yǎng)時間的長短將直接影響到目的基因整合及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)量。外植體經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染后，T-DNA須經(jīng)16 h以上才能向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移[10]。在本研究中，煙草葉片預(yù)培養(yǎng)36 h轉(zhuǎn)化效率最高，煙草轉(zhuǎn)化時農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)時間以48 h為宜。MAP30是一種非常有效的廣譜抗腫瘤、抗病毒植物蛋白?；诔杀炯皝碓吹确矫嬉蛩兀参锘蚬こ淌谴笈可a(chǎn)MAP30重組蛋白的首選方法。煙草作為基因轉(zhuǎn)化的模式植物被廣泛用于遺傳轉(zhuǎn)化研究[11-12]。煙草生長周期短，易于得到再生植株，蛋白質(zhì)含量高，作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白，生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

盡管有許多問題還需要作進(jìn)一步探討，但利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白是一種經(jīng)濟(jì)有效的途徑。

[1] Lee H S,Huang P L,Nara P L,et al.MAP30:A new inhibitor of HIV infection and replication[J].FEBS Letters,1990,272(1-2):12.

[2] 林育泉,周鵬,曾召綿.苦瓜MAP30蛋白基因克隆、表達(dá)及其抗腫瘤活性研究[J].中國生物工程雜志,2005,25(5):60-66.

[3] 孟延發(fā),孟雪琴,張雪梅,等.苦瓜籽核糖體失活蛋白的基本性質(zhì)研究[J].蘭州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2000,36(4):80.

[4] Lee H S,Huang P L,Chen H C,et al.Anti HIV and anti tumor activities of recombinant MAP30 from bitter melon[J].Gene,1995,161(2):151.

[5] Huang P L,Chen H C,Kung H F,et al.Anti HIV plant proteins catalyze to pological changes of DNA into inactive forms[J].Biofactors,1992,4(1):37.

[6] 高玉忠,吳光耀,張?zhí)烀?重組苦瓜蛋白MAP30及其制劑的研制[J].中國生化藥物雜志,2003,24(1):45.

[7] 劉榮梅,李鳳蘭,胡國富,等.轉(zhuǎn)CBF3基因煙草的抗寒性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,42(1):119-123.

[8] 李晶,劉煜,嵩連梅,等.轉(zhuǎn)DREB1A基因提高煙草抗逆性的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,42(1):124-129.

[9] Groot M J A,Bundock P,Hooykaas P J J,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation offilamentous fungi[J].Nature Biotechnology,1998,16:839-842.

[10] 王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程[M].2版,北京:科學(xué)出版社,2002:393.

[11] 張付云,李偉,張瑛,等.NtSKP1基因的反義載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的產(chǎn)生[J].生物技術(shù)通報,2010(4):145-149.

[12] 周穎.玉米核糖體失活蛋白基因z108在煙草原生質(zhì)體中的轉(zhuǎn)化及其表達(dá)[J].生物技術(shù)通報,2010(4):100-102.