組織因子在翼狀胬肉中的表達(dá)

李景翠 張雪菲

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，與腫瘤具有相似性。翼狀胬肉是具有增殖性、侵襲性和高度血管化的組織［1］，而且翼狀胬肉中存在變異細(xì)胞，這也是腫瘤的特性之一［2］。Kase等［3-4］研究表明，翼狀胬肉表皮細(xì)胞與正常結(jié)膜細(xì)胞相比具有非常強的增殖活性。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知的在新生血管形成過程中起主要作用的刺激因子，其能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，增加血管的通透性，誘導(dǎo)毛細(xì)血管管腔形成，而其在翼狀胬肉中的作用也已得到證實［5］。有研究報道，在腫瘤組織中組織因子(tissue factor，TF)能上調(diào)VEGF的表達(dá)［6］。TF是一種跨膜糖蛋白，能與凝血因子Ⅶ(FⅦ)結(jié)合后激活凝血通路，這種相互作用能觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號，并由G蛋白偶聯(lián)蛋白酶激活受體與黏附因子和其他因子介導(dǎo)［7］。TF受致癌性和分化途徑的調(diào)節(jié)，在腫瘤發(fā)生、生長、血管生成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用［7-9］。本實驗的目的是應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測TF在初發(fā)型進(jìn)展期翼狀胬肉組織及正常球結(jié)膜組織中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集我院眼科翼狀胬肉患者手術(shù)切除的標(biāo)本30例，均為初發(fā)型進(jìn)展期，其中男16例、女14例;平均年齡54.8歲。選取20例正常的眼結(jié)膜組織作為對照，男女各10人，平均年齡53.0歲。眼科檢查排除沙眼、瞼緣炎、過敏性結(jié)膜炎及其他眼表疾病。初發(fā)進(jìn)展期翼狀胬肉:結(jié)膜及結(jié)膜下組織增生肥厚，呈三角形侵入角膜，既往未進(jìn)行翼狀胬肉切除。正常眼結(jié)膜組織取自白內(nèi)障與斜視及單純孔源性視網(wǎng)膜脫離復(fù)位手術(shù)患者鼻側(cè)球結(jié)膜(均征得患者同意)。

1.2 主要試劑及儀器 試劑:兔抗人TF多克隆抗體、SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒;DAB試劑盒(均購買自武漢博士德生物工程有限公司)。儀器:烤箱、高壓鍋、冰箱、光學(xué)顯微鏡等。

1.3 標(biāo)本處理與切片 標(biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%甲醛液固定24 h后取材，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，60℃烘片后，45℃烘箱保存6 h。標(biāo)本經(jīng)蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察翼狀胬肉與人正常球結(jié)膜標(biāo)本的組織學(xué)表現(xiàn)。

1.4 SABC法免疫組織化學(xué)染色 處理好的切片脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗2 min×3次。高壓鍋抗原修復(fù)后，50 g·L－1BSA(封閉液)試劑室溫封閉20 min，滴加一抗(兔抗人TF多克隆抗體，其工作濃度1∶200)，陰性對照:用0.01 mol·L－1PBS液替代一抗，4℃冰箱過夜。滴加二抗:聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG，最后用DAB光鏡下顯色并觀察，流水終止染色。蘇木素輕度復(fù)染、脫水，透明，封片、觀察。鏡下細(xì)胞內(nèi)有黃染顆粒即為陽性，不著色為陰性。每張切片在高倍顯微鏡下(200倍)隨機(jī)選擇5個視野，計算每個視野陽性細(xì)胞表達(dá)率，取平均值作為該標(biāo)本的陽性細(xì)胞表達(dá)率。TF表達(dá)結(jié)果分為:陰性(－):無陽性細(xì)胞;弱陽性(+):陽性細(xì)胞表達(dá)率小于50%;強陽性(++):陽性細(xì)胞表達(dá)率大于50%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 11.7軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.001為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

TF在翼狀胬肉組織的表達(dá)定位于上皮細(xì)胞胞質(zhì)(圖1)，在翼狀胬肉中的陽性細(xì)胞表達(dá)率為86.67%(26/30)。在正常結(jié)膜組織上皮細(xì)胞中無表達(dá)或呈弱陽性表達(dá)(圖2)，其陽性細(xì)胞表達(dá)率為15.00%(3/20)。在正常結(jié)膜組織和初發(fā)翼狀胬肉組織中，TF表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.301，P＜0.001;見表1)。

表1 TF在翼狀胬肉及正常結(jié)膜組織中的表達(dá)Table 1 Expression of TF in primary pterygium and normal conjunctiva

Figure 1 The positive expression of TF in pterygium(×400)TF在翼狀胬肉中陽性表達(dá)(×400)

Figure 2 The negative expression of TF in normal conjunctiva(× 400)TF在正常結(jié)膜組織中陰性表達(dá)(×400)

3 討論

TF是相對分子質(zhì)量為47 000的跨膜糖蛋白受體，由263個氨基酸殘基構(gòu)成，結(jié)構(gòu)域可分為3段: 1～219位氨基酸構(gòu)成胞外區(qū)，220～242位氨基酸構(gòu)成跨膜區(qū)，243～263位氨基酸殘基構(gòu)成胞內(nèi)區(qū)。TF是血液中FⅦ的膜受體，正常血管內(nèi)皮細(xì)胞表面并不表達(dá)TF蛋白，而在腫瘤組織中，TF常在腫瘤細(xì)胞及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)。由于腫瘤血管結(jié)構(gòu)的不完整，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的TF容易與血液中的FⅦ結(jié)合，從而引發(fā)臨床腫瘤患者各種與凝血異常相關(guān)的疾?。?0］。FⅦa/TF誘導(dǎo)的信號途徑具有多樣性，它激活誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號在很大程度上隨細(xì)胞類型不同而有差別，但總的來說FⅦa/TF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號分別或協(xié)同參與了TF相關(guān)的血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和生長［11］。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段的過程，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要前提。ECM中起降解作用的蛋白酶主要有纖溶酶原激活物(plasminogen activator，PA)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)及組織蛋白酶。PA分為尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)和組織型纖溶酶原激活物(t-PA)。PA可以激活纖溶酶原，使其轉(zhuǎn)化為有活性的纖溶酶。纖溶酶具有高度的蛋白水解活性，能夠降解ECM成分，從而促進(jìn)腫瘤的局部浸潤和轉(zhuǎn)移［12］。腫瘤細(xì)胞表面TF介導(dǎo)凝血途徑活化生成凝血酶，凝血酶可以上調(diào)u-PA和t-PA的表達(dá)［13］，從而起到降解ECM的作用，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP是一類蛋白水解酶，是目前所知的最重要的基質(zhì)降解酶類之一。MMP主要的生理功能是降解ECM成分，如膠原、明膠、彈性蛋白、纖連蛋白和蛋白聚糖等［14］。降解ECM、突破基底膜是腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，MMP是參與該過程的重要的蛋白水解酶，是一種重要的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子［15］，TF通過細(xì)胞內(nèi)配體ABP280的募集并與TF結(jié)合，造成皮質(zhì)層肌動蛋白的重新聚合，而細(xì)胞骨架成分，如肌動蛋白的多聚可產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號并調(diào)節(jié)MMP表達(dá)［16］，從而增強腫瘤降解基質(zhì)的能力。而 u-PA與 MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10在翼狀胬肉中的表達(dá)已經(jīng)證實，u-PA對 MMP形成有促進(jìn)作用［17-21］。TF受分化途徑影響，能在具有間質(zhì)特點的上皮腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。有研究表明，TF與腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有關(guān)，并在其發(fā)展中起作用［5］。EMT是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有活動能力、能夠在ECM間自由移動的間質(zhì)細(xì)胞的過程，它以上皮細(xì)胞極性的喪失及間質(zhì)特性的獲得為重要特征［22］。這種表型的轉(zhuǎn)化可以使腫瘤細(xì)胞擺脫細(xì)胞與細(xì)胞間的連接，表現(xiàn)得更具侵襲性。而EMT是翼狀胬肉進(jìn)展的主要因素，EMT標(biāo)志性改變在翼狀胬肉上皮細(xì)胞可以找到［23］。因此，我們推測TF在翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制中可能也起了一定的作用。

在本實驗中，我們運用免疫組織化學(xué)的方法證實了TF在翼狀胬肉組織中有表達(dá)，而且主要表達(dá)在翼狀胬肉上皮細(xì)胞，其陽性表達(dá)率為76.67%，在正常眼結(jié)膜組織上皮細(xì)胞中陽性表達(dá)率15.00%。本結(jié)果表明，TF在翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制中可能起了一定的促進(jìn)作用，選擇性的TF抑制劑有可能成為治療翼狀胬肉的新靶點。

1 Gebhardt M，Mentlein R，Schaudig U，Pufe T，Recker K.Differential expression of vascular endothelial growth factor implies the limbal origin of pterygia［J］.Ophthalmology，2005，112(6): 1023-1030.

2 Spandidos DA，Sourvinos G，Kiaris H，Tsamparlakis J.Microsatellite instability and loss of heterozygosity in human pterygia［J］.Br J Ophthalmol，1997，81(6):493-496.

3 Kase S，Takahashi S，Sato I，Nakanishi K，Yoshida K.Expression of p27(KIP1)and cyclin D1，and cell proliferation in human pterygium［J］.Br J Ophthalmol，2007，91(7):958-961.

4 Kase S，Osaki M，Sato I，Takahashi S，Nakanishi K.Immunolocalisation of E-cadherin and beta-catenin in human pterygium［J］.Br J Ophthalmol，2007，91(9):1209-1212.

5 Lee DH，Cho HJ，Kim JT，Choi JS，Joo CK.Expression of vascular endothelial growth factor and inducible nitric oxide synthase in pterygia［J］.Cornea，2001，20(7):738-742.

6 Bluff JE，Amarzguioui M，Slattery J，Reed MW，Brown NJ.Antitissue factor short hairpin RNA inhibits breast cancer growth in vivo［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，128(3):691-701.

7 Milsom CC，Yu JL，Mackman N，Micallef J，Anderson GM.Tissue factor regulation by epidermal growth factor receptor and epithelial-to-mesenchymal transitions:effect on tumor initiation and angiogenesis［J］.Cancer Res，2008，68(24):10068-10076.

8 Rickles FR.Mechanisms of cancer-induced thrombosis in cancer［J］.Pathophysiol Haemost Thromb，2006，35(1-2):103-110.

9 Ruf W，F(xiàn)ischer EG，Huang HY，Miyagi Y，Ott I.Diverse functions of protease receptor tissue factor in inflammation and metastasis［J］.Immunol Res，2000，21(2-3):289-292.

10 Yu JL，May L，Lhotak V，Shahrzad S，Shirasawa S，Weitz JI，et al.Oncogenic events regulate tissue factor expression in colorectal cancer cells:implications for tumor progression and angiogenesis［J］.Blood，2005，105(4):1734-1741.

11 Fernandez PM，Rickles FR.Tissue factor and angiogenesis in cancer［J］.Curr Opin Hematol，2002，9(5):401-406.

12 Francis JL，Biggerstaff J，Amirkhosravi A.Hemostasis and malignancy［J］.Semin Thromb Hemost，1998，24(2):93-109.

13 Hayakawa Y，Tazawa S，Ishikawa T，Niiya K，Sakuraqawa N.Transcriptional regulation of tissue and urokinase-type plasmlnogen actlvator genes by thrombin in human fetal lung fibroblasts［J］.Thromb Haemost，1995，74(2):704-710.

14 Shapiro SD.Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix:biological consequences［J］.Curr Opin Cell Biol，1998，10(5):602-608.

15 Engers R，Cabbert HE.Mechanisms of tumor metastasis:cell biological aspects and clinical implications［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2000，126(12):682-692.

16 Ott I，F(xiàn)ischer EG，Miyaqi Y，Mueller BM，Ruf W.A role for tissue factor in cell adhesion and migration mediated by interaction with actin-binding protein 280［J］.J Cell Biol，1998，140(5): 1241-1253.

17 Girolamo ND，Wakefield D，Coroneo MT.Differential expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors at the advancing pterygium head［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(13):4142-4149.

18 Di Girolamo N，McCluskey P，Lioyd A，Coroneo MT，Wakefield D.Expression of MMPs and TIMPs in human pterygia and cultured pterygium epithelial cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(3):671-679.

19 Yang SF，Lin CY，Yang PY，Chao SC，Ye YZ，Hu DN.Increased expression of gelatinase(MMP2 and MMP9)in pterygia and pterygium fibroblast with disease progression and activation of protein kinase C［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50(10): 4588-4596.

20 Tsai YY，Chiang CC，Yeh KT，Lee H，Cheng YW.Effect of TIMP-1 in pterygium invasion［J］.Invest Ophthalmol Vic Sci，2010，51 (7):3462-3467.

21 Chao SC，Hu DN，Yang PY，Lin CY，Yang SF.Overexpression of urokinase-type plasminogen activator in pterygia and pterygium fibroblasts［J］.Mol Vis，2011，6(17):23-31.

22 Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transitions in tumor progression［J］.Curr Opin Cell Biol，2003，15(6):740-746.

23 Kato N，Shimmura S，Kawakita T，Miyashita H，Ogawa Y.Betacatenin activation and epithelial-mesenchymal transition in the pathogenesis of pterygium［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48(4):1511-1517.