應用5/6腎切除模型研究7首臨床有效驗方抗腎纖維化作用*

邵命海，何立群，謝婷婷，鄒 赟，王 東，劉偉芳，黃 迪陳 剛，曹和欣，吳 鋒，林日陽，吳同茹，劉英超

慢性腎衰的共同病變是腎臟纖維化，臨床有眾多方劑對慢性腎衰有效。為提高臨床療效，開發(fā)出抗腎纖維化的新藥，旨在中醫(yī)藥理論指導下，分析文獻報道，結合臨床實踐和眾多專家意見，根據(jù)不同治則挑選出有一定研究基礎的7首方劑，即健脾清化方［1-4］、腎衰 3 號方［5-7］、葆腎 3 號方［8］、慢性腎功能衰竭湯劑方［9］、滋補肝腎湯合化濕湯［10］、抗纖靈顆粒［11-14］和人參白術湯［15］作為研究對象，選用經(jīng)典腎纖維化的UUO模型和大鼠 Platt模型［16］，動態(tài)評價與篩選方劑。這種通過2種模型比較不同治則腎衰方的對比研究并不多見，將為后期研究有效成分、組分與組分配伍的抗腎纖維化作用機制奠定基礎，現(xiàn)先將Platt模型實驗結果發(fā)表如下。

1 材料與方法

1.1 動物

健康成年雄性SD大鼠(SPF級)，8周齡，體重200g±20 g，由上海西普爾 －必凱實驗有限公司提供。大鼠分籠飼養(yǎng)于25℃、12h光照、45%濕度的環(huán)境中，自由飲水，進食標準普通飼料。

1.2 造模方法

大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔注射，備皮，消毒手術區(qū)后鋪巾，距左脊肋骨1.5 cm處斜向外方切口，經(jīng)后腹膜暴露腎臟，分離腎周脂肪后，弧型切除2/3腎組織(主要切除皮質(zhì)部分)，用明膠海綿壓迫止血，當切面上不再有活動性出血后復位剩余左腎，縫合;1周后再次手術切除整個右腎。另取正常大鼠10只，僅作背部切口，分2次剝離左右腎包膜，保留腎上腺并作為假手術組。

1.3 動物分組

術后1周目內(nèi)眥采血，測定腎功能，根據(jù)血清肌酐水平分為假手術組、模型組、健脾清化方組(JPQHR)、腎衰 3號方組(SS3R)、葆腎 3號方組(BS3R)、慢性腎功能衰竭湯劑方組(SGNSJR)、滋補肝腎湯合化濕湯組(ZBGSHSR)、人參白術湯組(RSBSR)、抗纖靈組(KXLP)和科素亞(Losartan)［17］對照組。

1.4 藥物制備(由中藥研究所制備提供)和使用劑量

健脾清化方:黨參15g，生黃芪15g，草果仁6g，蒼術10g，黃連3g，酒制大黃9g;大鼠用量按照人體6倍劑量(下同)換算為4.97g/kg/d。腎衰3號方:人參 10g，黃芪 30g，白術 15g，葛根 15g，淫羊藿 15g，制山茱萸 20g，何首烏 15g，丹參 10g;11.1g/kg/d。葆腎3號方:黃芪30g，丹參15g，酒制大黃9g，仙靈脾15g，蟲草發(fā)酵菌粉9g，6.7g/kg/d。慢性腎功能衰竭湯劑方:人參10g，制附子10g，制山茱萸15g，豬苓 15g，澤瀉 15g，益母草 30g，地龍 20g，川芎 15g，丹參30g，酒制大黃6g，16.8g/kg/d。滋補肝腎湯合化濕湯:女貞子12g，生黃芪30g，車前子10g，土茯苓10g，丹參 12g，川芎 15g，半枝蓮 10g，生地黃 15g，制山茱萸 10g，枸杞子 10g，煅牡蠣 10g，12.3g/kg/d。人參白術湯:人參 10g，白術 6g，茯苓 6g，檳榔 6g，黃芪 6g，當歸 6g，生地 6g，3.9g/kg/d?？估w靈顆粒:丹參 15g，當歸 15g，桃仁 12g，酒制大黃 12g，炒牛膝15g;5.9g/kg/d。對照藥:科素亞8.6mg/kg/d，杭州默沙東制藥有限公司提供。上述各中藥組方均水煎濃縮備用，使用時稀釋，控制灌胃體積2ml。

1.5 治療方案

分組后每日藥物灌胃1次共60d，假手術組和模型組生理鹽水2ml灌胃。

1.6 觀察指標及檢測方法

(1)一般情況:死亡率、體重等;(2)血清尿素氮、肌酐和24h尿蛋白定量;(3)腎臟病理:取出左側(cè)腎臟于 10%甲醛固定，備至石蠟切片，HE、MASSON染色，計算腎小球硬化指數(shù)(GSI)，采用Image-Pro Plus5.1圖像分析系統(tǒng)計算MASSON染色藍染纖維的陽性面積比例。

1.7 統(tǒng)計分析

應用 SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差(珋x±s)表示，組間比較用單因素方差分析檢驗 ，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

造模大鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、體毛無光澤、攝食減少、身體消瘦、蜷縮等現(xiàn)象，治療組大鼠進食增多，活動逐漸靈活。其中健脾清化方組體重明顯大于模型組和其他治療組(P＜0.05)，與假手術組相比無明顯降低(P＞0.05)。

2.2 治療后各組尿蛋白排泄的比較

表1顯示，健脾清化方、滋補肝腎湯合化濕湯可降低24h尿蛋白定量(24hUP)(P＜0.05)，組間無差異，與科素亞療效相當，其余各組無明顯降低。

表1 治療后各組尿蛋白排泄的比較Table 1 The urinary albumin excr etioncomparison after treatment

2.3 治療前后腎功能比較

表2顯示，造模成功大鼠根據(jù)血清肌酐(Scr)分組，分組后各治療組和模型組尿素氮、肌酐基線水平無學差異(P＞0.05)。治療60d后，血清尿素氮水平腎衰3號方組無明顯下降(P＞0.05);其余各中藥復方組降低(P＜0.05)，組間差異無意義(P＞0.05)。腎衰3號方組 Scr下降(P＜0.05)，其余各治療組顯著下降(P＜0.01)。

表2 治療前后各組血清尿素氮和肌酐水平比較Table 2 Before and After Treatment BUN and Scr Level Comparison

2.5 腎臟病理

肉眼觀察:模型組和各治療組殘呈腎代償性肥大，顏色黯紅，表面有多數(shù)隆起，和周圍組織無明顯黏連，殘腎易分離。

光鏡:假手術組腎小球未見明顯異常;模型大鼠小球增生、肥大，系膜細胞輕度增生，可見局灶節(jié)段性球囊黏連和硬化，基質(zhì)增寬不明顯，腎小管偶有輕中度變性，偶見小管內(nèi)蛋白管型，間質(zhì)有炎性細胞浸潤，藍染纖維在系膜區(qū)、小球周圍明顯增加;各治療組病變明顯減輕，健脾清化方組、抗纖靈組病變減輕更明顯，人參白術湯對病理損害的減輕作用較差。

進一步將MASSON染色切片進行半定量分析，對腎小球硬化程度評分:采用Raij等的半定量方法評估腎小球硬化程度，高倍鏡(×400)下每張切片隨機選取均觀察6個完整腎小球，根據(jù)腎小球硬化灶所占比例分為0～4級(0為腎小球無病變，1級為腎小球受損傷不足25%，2級為腎小球受損傷不足26% ～50%，3級為受損傷51% ～75%，4級為受損傷76% ～100%)，然后計算 GSI;同時采用 Image-Pro Plus5.1圖像分析系統(tǒng)計算藍染纖維的陽性面積比例。表1顯示，各中藥組GSI和藍染纖維陽性面積率減少(P＜0.05)，健脾清化方和抗纖靈組有顯著差異(P＜0.01)，與人參白術湯組比較有差異(P ＜0.05)。

表3 治療后各組腎小球硬化指數(shù)(GSI)和藍染纖維陽性面積率比較Table 3 After Treatment，the GSI and MASSON Dyeing Aizen Fiber Positive Area Rate Comparison

3 討論

慢性腎衰病機錯綜復雜，辨證分型變化多端，臨床用于治療本病的方藥眾多，僅我院治療慢性腎衰就有抗纖靈顆粒、腎衰沖劑系列方。為提高臨床療效，創(chuàng)制療效確切、組分明確、機理清晰的現(xiàn)代中藥，挑選不同治則的7首有效臨床驗方通過Platt大鼠模型對比研究，發(fā)現(xiàn)各方都可改善一般情況，降低血肌酐，減輕腎臟病理損害。通過對比發(fā)現(xiàn)，補氣活血、清化濕熱、攻補兼施的健脾清化方和抗纖靈，較以補虛為主的腎衰3號方和人參白術湯改善腎纖維化和腎功能的作用更明顯，可能有以下幾個原因:(1)補氣活血、清化濕熱、攻補兼施的治則更切中慢性腎衰的“正虛邪實，虛實夾雜”病機特點;(2)與2006年［18］中華中醫(yī)藥學會腎病分會辨證分型試行方案中正虛和邪實分型一致;(3)與臨床證候調(diào)查結果契合［19、20］:正虛以脾腎氣虛型為多，邪實則是濕熱瘀血貫穿疾病始終，脾腎氣虛兼濕熱瘀血是最主要的證型;(4)比較符合研究現(xiàn)狀，眾多使用補腎活血、清化濕熱方藥［21、22］可以抗腎纖維化，延緩腎衰進展。

總之，采用同一模型，挑選不同治則、角度各異的有效臨床驗方，進行干預腎纖維化的對比研究，發(fā)現(xiàn)補氣活血、清化濕熱、攻補兼施的中藥驗方優(yōu)于單純補益劑，說明健脾益氣、清化濕熱兼以活血化瘀作為臨床最常用的慢性腎衰治則，具有其內(nèi)在的科學性和重要的臨床價值。同時，從中得到一個新的提示，除活血化瘀和清化濕熱類藥物可以抗腎纖維化，延緩腎病進展，單純補益脾腎的中藥也有一定的作用，其作用機制有待進一步的探索。

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