頂復(fù)門原蟲嘌呤代謝研究進展

山 丹，劉 群

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193）

頂復(fù)門原蟲是一類專性細胞內(nèi)寄生蟲，包括瘧原蟲（Plasmodium）、巴貝斯蟲（Babesia）、隱孢子蟲（Cryptosporidium）、等孢球蟲（Isospora）、艾美耳球蟲（Eimeria）、住肉孢子蟲（Sarcocystis）和弓形蟲（Toxoplasma）等多種重要寄生原蟲。蟲體入侵宿主細胞主要通過蟲體前端的頂復(fù)合器分泌的多種蛋白發(fā)揮粘附、入侵等功能，而完成入侵、發(fā)育和繁殖等生命活動所需能量的重要物質(zhì)之一是嘌呤。嘌呤是所有生物所必需的物質(zhì)，是核酸的組成成分，是細胞的能量來源，也是代謝途徑的共作用因子或底物。不同種類的寄生蟲所需嘌呤的來源不同，或利用從小分子物質(zhì)從頭合成嘌呤，即從頭合成途徑（De novo synthesis）；或利用宿主的游離堿基和核苷重轉(zhuǎn)化為相應(yīng)核苷酸，即補救途徑（salvage pathway）。

頂復(fù)門原蟲均喪失了從頭合成嘌呤環(huán)的能力［1］。它們依賴于捕捉、轉(zhuǎn)運和補救機制從宿主竊取嘌呤，補充自身的核酸儲備［2］。這些代謝途徑在頂復(fù)門原蟲體內(nèi)有序進行，其所寄生的細胞、組織和環(huán)境中嘌呤來源的不同很可能反映了不同種寄生蟲需求的不同。如弓形蟲，即使在營養(yǎng)最豐富的培養(yǎng)基中，蟲體也不能在細胞外繁殖。但是，即使在阻礙蛋白合成的宿主細胞或喪失RNA和DNA合成功能的無核細胞內(nèi)，弓形蟲依然能夠獲取嘌呤，滿足胞內(nèi)增殖的全部需求［3］。本文以研究報道較多的弓形蟲、瘧原蟲和隱孢子蟲3種原蟲為主要代表，簡述頂復(fù)門原蟲嘌呤代謝的研究進展。

長期以來，捕獲、轉(zhuǎn)運和補救嘌呤途徑一直被視為寄生蟲進化的最大缺陷，而成為防治寄生蟲藥物的靶標，直接取得了顯著成效?；蚬こ虨榧纳x的代謝研究開辟了新的天地。觀察敲除或整合核酸代謝相關(guān)基因的工程蟲株的表現(xiàn)型，觀察正?；蛲蛔兿x株與突變宿主細胞相互作用，為寄生蟲的嘌呤代謝研究提供了新思路和新方法。

1 捕獲與轉(zhuǎn)運

基于對利什曼原蟲和錐蟲的大量研究，近來人們逐漸對幾種原蟲的嘌呤轉(zhuǎn)運能力以及嘌呤轉(zhuǎn)運體有了清晰的認識。轉(zhuǎn)運體即介導(dǎo)分子或離子轉(zhuǎn)運跨過生物膜的物質(zhì)。核苷和堿基的轉(zhuǎn)運體有兩類：一類 為 sodium-dependent concentrative nucleoside transporters（CNT）；一 類 為 non-concentrative equilibrative nucleoside transporters（ENT）。哺乳動物細胞和細菌同時具有CNT和ENT兩類轉(zhuǎn)運體，原蟲僅有ENT類轉(zhuǎn)運體［4］。

1.1 嘌呤轉(zhuǎn)運體的基因分析 目前，已確定瘧原蟲基因組編碼嘌呤轉(zhuǎn)運體pf NT1，并推測存在其他3個ENT同系物［5－6］。與瘧原蟲相似，弓形蟲基因組編碼Tg AT1及3個ENT同系物Tg NT1、Tg NT2和 Tg NT3［7］。

近期研究顯示，Tg AT1、Tg NT1和Tg NT3均可在弓形蟲速殖子、緩殖子和孢子化卵囊各個階段表達，而Tg NT2在上述階段均不表達［8］。Tg AT1和Tg NT3定位于速殖子的漿膜，Tg NT1在胞質(zhì)內(nèi)表達，不在弓形蟲的任何已知細胞器內(nèi)表達。除弓形蟲轉(zhuǎn)運體Tg AT1和瘧原蟲pf NT1外，近期發(fā)現(xiàn)的ENT其他同系物的功能尚未確定［8］。

1.2 嘌呤轉(zhuǎn)運體及其功能特征 Plagemann（1986）提出了弓形蟲嘌呤捕獲模型的第一個假說，即弓形蟲可從宿主ATP獲取原料合成嘌呤，胞外弓形蟲能充分利用宿主ATP或AMP的核苷成分合成自身核苷酸［9］。然而，第一個被確定為弓形蟲腺苷轉(zhuǎn)運體的是Tg AT1，是一種非離子濃度依賴的低親和力腺苷轉(zhuǎn)運體。這一體系很可能需要顯著高于宿主細胞生理水平的腺苷濃度。后續(xù)研究結(jié)果也證實，在細胞內(nèi)的速殖子、納蟲空泡的間隙和納蟲空泡膜均未檢測到水解ATP 5′磷酸酶活性，說明弓形蟲不具備充分利用宿主細胞核苷酸的能力。

目前，弓形蟲的數(shù)個嘌呤轉(zhuǎn)運體的功能己相繼得到驗證。Tg AT1是腺苷、鳥苷和次黃苷的一種低親和力轉(zhuǎn)運體，可被藥物“雙嘧達莫（dipyridamole）”阻斷，也可被過量的次黃苷、間型毒素和次黃嘌呤所抑制，但不能被過量嘧啶抑制［10］。這一轉(zhuǎn)運體是具嘌呤選擇性的廣譜轉(zhuǎn)運體。Tg AT2是弓形蟲的第2個腺苷轉(zhuǎn)運系統(tǒng)［11］，也是一高親和力的廣譜轉(zhuǎn)運體，暗示這一轉(zhuǎn)運系統(tǒng)是蟲體獲取多種核苷的有效途徑。類似研究確定了第3個轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Tg NT1，并證實Tg NT1是目前所發(fā)現(xiàn)的第一個具有選擇性轉(zhuǎn)運嘌呤堿基功能的轉(zhuǎn)運體。競爭動力學(xué)試驗結(jié)果顯示，TgNT1對次黃嘌呤、鳥嘌呤和黃嘌呤均具有高親和力。

細胞外速殖子的胞質(zhì)膜鑲嵌著Tg AT2和TgNT1轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)，具有捕獲嘌呤堿基的強大能力，甚至能捕獲納蟲空泡間隙的低濃度嘌呤堿基和核苷?？赡苷沁@種較強捕獲嘌呤的能力使得弓形蟲可寄生于幾乎所有哺乳動物細胞。由于弓形蟲的納蟲空泡膜具有分子篩的功能［12］，所以并未見堿基、核苷和核苷酸滲透或富集在納蟲空泡間隙的報道。

ENT核苷轉(zhuǎn)運體家族由多達11個成員組成，惡性瘧原蟲的ENT為pf NT1。pf NT1位于寄生蟲胞質(zhì)膜［13］，在各個發(fā)育階段均表達。抑制試驗顯示pf NT1為嘌呤和嘧啶的廣譜轉(zhuǎn)運體，pf NT1既能轉(zhuǎn)運D型核苷，又能轉(zhuǎn)運L型核苷。

迄今沒有發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲的嘌呤轉(zhuǎn)運體。

2 嘌呤補救途徑

對多種頂復(fù)門原蟲的嘌呤研究均集中在如何利用宿主的嘌呤堿基和核苷作為寄生蟲的核苷酸原料。

研究表明，弓形蟲不能從頭合成嘌呤，因而必須依賴捕獲宿主細胞的嘌呤加以利用。弓形蟲擁有強大的嘌呤補救能力，或許正是因為如此，弓形蟲方可在種類眾多的哺乳動物細胞內(nèi)生存繁殖。相反，在頂復(fù)門原蟲中微小隱孢子蟲擁有的補救機制最為簡單，這種能力的退化很可能與其營養(yǎng)豐富且寄生環(huán)境的局限相關(guān)。惡性瘧原蟲的補救途徑比弓形蟲相對較少。然而，瘧原蟲在紅細胞內(nèi)寄生增殖，它擁有其他頂復(fù)門原蟲不具備的一條嘌呤補救途徑。

2.1 弓形蟲的嘌呤補救途徑 納蟲空泡間隙的腺苷經(jīng)質(zhì)膜的腺苷轉(zhuǎn)運體運送至蟲體內(nèi)，在腺苷激酶（AK）的作用下，生成一磷酸腺苷（AMP）。AMP通過一磷酸腺苷脫氨酶（AMPD）的脫氨作用生成一磷酸次黃苷（IMP），繼而脫氫為一磷酸黃苷（XMP），最終合成一磷酸鳥苷。同時，次黃嘌呤核苷可與次黃嘌呤相互轉(zhuǎn)化，在次黃嘌呤黃嘌呤核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶（HXGPRT）的作用下生成IMP，進而可完成AMP向GMP的轉(zhuǎn)化。弓形蟲可通過上述兩條主要途徑，即AK途徑和HXGPRT途徑，利用宿主嘌呤滿足自身需求。

AK途徑是弓形蟲最為重要的補救途徑。用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達弓形蟲的AK蛋白，通過生物化學(xué)、動力學(xué)和形態(tài)學(xué)研究，結(jié)果均顯示寄生蟲與哺乳動物AK蛋白存在顯著差異，AK蛋白似乎可能成為藥物的靶位點［14］。

與惡性瘧原蟲和微小隱孢子蟲不同，弓形蟲擁有功能強大的嘌呤補救途徑，利用宿主細胞堿基和核苷即可滿足自身的需要。這種特性可以很好地解釋弓形蟲可利用不同的嘌呤來源，寄生于宿主的幾乎有核細胞內(nèi)。

單獨敲除寄生蟲的AK或HXGPRT基因，突變蟲株的生長狀況出現(xiàn)細微但可檢測到的缺陷。AK基因缺失蟲株的生長速率僅為正常蟲株的7.6%，而HXGPRT基因缺失蟲株的生長速率僅為正常蟲株的3.7%［15］。這一結(jié)果表明，嘌呤的捕獲或許是限制寄生蟲生長速率的關(guān)鍵因素。在宿主細胞供給充足腺苷的條件下，AK基因缺失蟲株似乎不能以全速正常生長速率生長繁殖。因此，捕獲多種宿主的嘌呤堿基或核苷，利用宿主的嘌呤合成自身核苷酸，這兩條補救途徑同時存在似乎是弓形蟲以最大速率生長繁殖所必需的。見圖1。

圖1 弓形蟲嘌呤轉(zhuǎn)運和補救途徑模式圖

2.2 微小隱孢子蟲的嘌呤補救途徑 由于沒有有效的方法體外培養(yǎng)微小隱孢子蟲，獲得用于生化試驗的純凈蟲體也頗為困難，在很大程度上限制了微小隱孢子蟲嘌呤補救途徑的研究［16］。微小隱孢子蟲基因組的發(fā)布第一次揭示了其如何利用宿主細胞的嘌呤滿足自身需求的機制。

值得注意的是，腺苷是微小隱孢子蟲可從小腸等寄生環(huán)境或宿主細胞獲得的惟一嘌呤來源。與弓形蟲和瘧原蟲相似，微小隱孢子蟲基因組編碼腺苷轉(zhuǎn)運體家族基因，腺苷轉(zhuǎn)運體可將宿主細胞的腺苷轉(zhuǎn)運至寄生蟲胞質(zhì)內(nèi)。該寄生蟲可通過AK補救途徑生成AMP，即利用腺苷合成自身的核苷酸，完全可滿足蟲體對腺嘌呤核苷酸和鳥嘌呤核苷酸的需求。

圖2 微小隱孢子蟲轉(zhuǎn)運和補救途徑模式圖

與弓形蟲嘌呤補救途徑的藥物靶點不同的是，參與微小隱孢子蟲嘌呤補救途徑的每一個酶均可能成為潛在的藥物靶點［17］。見圖2。2.3 惡性瘧原蟲的嘌呤補救途徑 與微小隱孢子蟲相比，惡性瘧原蟲的嘌呤補救途徑更多，且各途徑間可相互轉(zhuǎn)化，但沒有弓形蟲的途徑多。惡性瘧原蟲專寄生于紅細胞，擁有高度適應(yīng)于其獨特寄生環(huán)境的嘌呤補救機制。紅細胞是高度分化的細胞，缺乏哺乳動物其他細胞的多種細胞功能，因而對嘌呤的需求很有限。

為滿足寄生蟲自身對嘌呤的需要，惡性瘧原蟲似乎能夠轉(zhuǎn)運黃嘌呤、次黃嘌呤和鳥嘌呤這3種堿基，以及腺苷、鳥苷和次黃苷這3種核苷［13］。它具有利用上述6種嘌呤來源的完美補救機制，并且這6種嘌呤來源可相互轉(zhuǎn)化。

惡性瘧原蟲缺乏從腺苷到AMP的直接轉(zhuǎn)化途徑，次黃嘌呤成為瘧原蟲合成嘌呤核苷酸的重要原料。次黃嘌呤是惟一能夠完全滿足寄生蟲對腺嘌呤核苷酸和鳥嘌呤核苷酸需求的嘌呤來源。

2.4 新發(fā)現(xiàn)的一條嘌呤補救途徑 在頂復(fù)門原蟲中，只有惡性瘧原蟲具有“多胺代謝生成物-5′甲基硫嘌呤循環(huán)”這一嘌呤補救途徑［2］。惡性瘧原蟲與弓形蟲不同，所寄生的紅細胞不能合成多胺，必須自身合成所需的多胺。

最近發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲的腺苷脫氨酶（ADA）具有識別5′甲基硫腺苷（MTA）并催化其向5′甲基硫次黃苷（MTI）轉(zhuǎn)化的新功能。此外，惡性瘧原蟲的嘌呤核苷激酶（PNP）具有催化MTI向次黃嘌呤轉(zhuǎn)化的特有功能。

惡性瘧原蟲ADA和PNP的特有酶催化特性構(gòu)成了從MTA到MTI再到次黃嘌呤的新代謝途徑，實現(xiàn)了從多胺到嘌呤的循環(huán)。研究表明，單獨利用宿主的次黃嘌呤似乎不足以支持瘧原蟲在體外培養(yǎng)。嘌呤循環(huán)途徑的中間產(chǎn)物次黃苷、腺苷和黃苷是惡性瘧原蟲維持正常生長繁殖所必需。體外研究表明，惡性瘧原蟲ADA和PNP是參與多胺生物合成的關(guān)建酶，也是藥物的潛在靶位點。見圖3。

圖3 微小隱孢子蟲轉(zhuǎn)運和補救途徑模式圖

3 展望

隨著抗原蟲藥物的廣泛應(yīng)用，藥物的抗藥性以及相應(yīng)的毒副作用嚴重限制了藥物的臨床應(yīng)用，篩選新型藥物成為防治原蟲病的當務(wù)之急。著眼于宿主與寄生蟲代謝機制的差異為確定潛在的藥物靶點提供了良好的策略。頂復(fù)門原蟲與其宿主的嘌呤代謝機制的差異之一，是寄生蟲缺乏從頭生物合成途徑，對于某些必需營養(yǎng)物質(zhì)的需求只能嚴格依賴于宿主細胞。近年來，應(yīng)用生物化學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)，揭示了弓形蟲、瘧原蟲以及隱孢子蟲等頂復(fù)門原蟲的嘌呤轉(zhuǎn)運和代謝機制，為彌補現(xiàn)存抗原蟲藥物的不足，治療頂復(fù)門原蟲病篩選潛在藥物靶點提供了理論依據(jù)。

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