阿膠泡騰片對小鼠免疫功能的影響

毛跟年， 宋怡敏， 毛瑞娟， 邵靜可

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

阿膠(CollaCoriiAsini) 又名驢皮膠、付致膠，其與人參、鹿茸并稱“中藥三寶”，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，是馬科動(dòng)物驢(EquusasinusL.)的皮經(jīng)去毛后熬制而成的板狀膠塊制劑，主要成分為膠原蛋白[2].阿膠具有很好的補(bǔ)血作用，中醫(yī)用來治療血虛萎黃、眩暈心悸、虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)和吐血尿血等癥[3].現(xiàn)代藥理研究表明，阿膠對血液、造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等方面均有明顯作用，具有增強(qiáng)記憶、抗疲勞、耐缺氧等作用[4].阿膠泡騰片是將原料阿膠塊粉碎過篩后，再經(jīng)過特殊工藝加工而成的片劑.目前還沒有阿膠泡騰片藥效研究的相關(guān)資料.本文通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究了阿膠泡騰片對小鼠免疫功能的影響，以便為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1受試樣品

阿膠泡騰片，陜西科技大學(xué)生命學(xué)院生藥實(shí)驗(yàn)室提供；原料阿膠塊，山東東阿阿膠股份有限公司提供.

1.1.2試劑

無水乙醇、氯化鈉、碳酸鈉等均為分析純試劑.

1.1.340 mL/L、200 mL/L雞血紅細(xì)胞混懸液

將加有抗凝劑的雞血，經(jīng)2000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀的紅細(xì)胞用生理鹽水輕輕吹打，經(jīng)2000 r/min離心10 min，反復(fù)洗滌3次后，再用生理鹽水分別配制成40 mL/L、200 mL/L雞紅細(xì)胞混懸液.

1.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，體重18～22 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXF(陜)2007-001.

1.1.5儀器設(shè)備

TDL-40B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；752型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)；游標(biāo)卡尺.

1.2 方法

1.2.1小鼠給藥劑量的確定

根據(jù)阿膠泡騰片中阿膠含量、成人每日推薦的阿膠使用量，以及人與動(dòng)物給藥劑量的換算關(guān)系，確定出小鼠阿膠泡騰片的等效劑量作為中等劑量，再以此為基礎(chǔ)確定出低劑量和高劑量.研究確定的阿膠泡騰片對低、中、高劑量組小鼠的每日灌胃量分別為1.85 g/kg體重、3.70 g/kg體重和7.40 g/kg體重，給藥體積0.1mL/10 g體重.

1.2.2免疫器官重量法[5]

取小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，空白對照組、陽性對照組、阿膠泡騰片低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組12只.阿膠泡騰片低劑量組、中劑量組及高劑量組小鼠分別灌胃1.85 g/kg、3.70 g/kg、7.40 g/kg體重阿膠泡騰片，給藥體積0.01 mL/g體重；陽性對照組灌胃等體積7.40 g/kg體重原料阿膠塊；空白組小鼠灌胃等體積蒸餾水.各組小鼠每天清晨空腹灌胃1次，連續(xù)14 d.末次灌胃24 h后，稱量各組小鼠體重，然后將小鼠脫臼處死，摘取脾臟、胸腺，稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù).

1.2.3小鼠碳廓清試驗(yàn)[6]

小鼠分組、給藥劑量、給藥方法及時(shí)間同“免疫器官重量法”.末次灌胃2h后，各組小鼠均尾靜脈注射0.01 mL/g體重用生理鹽水稀釋5倍的墨汁，立即計(jì)時(shí)，于注射墨汁后2min、15 min時(shí)經(jīng)尾靜脈采血0.05 mL，移入到含2mL0.1% Na2CO3溶液的試管中，混勻后測定吸光度，計(jì)算碳廓清指數(shù)K(carbon expurgation).

(1)

其中A1為2min時(shí)所采血樣的吸光值；A2為15 min時(shí)所采血樣的吸光值；t1為2min；t2為15 min.

1.2.4小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)[7]

小鼠分組、給藥劑量、給藥方法及時(shí)間同“免疫器官重量法”.在灌胃至第6d時(shí)，各組小鼠均腹腔注射0.01 mL/g體重40 mL/L雞血紅細(xì)胞混懸液，進(jìn)行致敏.在灌胃第10 d，各組小鼠于左后足跖部皮下均注射0.01 mL/g體重200 mL/L雞血紅細(xì)胞混懸液，進(jìn)行攻擊.同時(shí)，于攻擊前及攻擊后24 h測量各組小鼠左后足跖同一部位厚度，以足跖增厚程度表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)值(delayed type hypersensitivity, DTH).

1.2.5數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 阿膠泡騰片對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

各組小鼠稱重后處死，摘取脾臟及胸腺，用生理鹽水清洗干凈并用濾紙擦干表面水分后，稱重，計(jì)算小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù).結(jié)果如表1所示.

由表1可知，灌胃不同劑量阿膠泡騰片和原料阿膠后，各試驗(yàn)組小鼠和陽性對照組小鼠免疫器官指數(shù)均有所增加.與空白對照組小鼠相比，各試驗(yàn)組小鼠和陽性對照組小鼠脾臟指數(shù)均有極顯著差異(P<0.01).阿膠泡騰片中劑量組、高劑量組及陽性對照組小鼠胸腺指數(shù)與空白對照組小鼠相比均存在顯著性差異(P<0.05)，但阿膠泡騰片低劑量組小鼠胸腺指數(shù)與空白組小鼠相比未見顯著差異(P>0.05).與陽性對照組相比，阿膠泡騰片各劑量組小鼠免疫器官指數(shù)均無顯著差異(P>0.05).表明所選用的阿膠泡騰片各劑量在增加小鼠免疫器官指數(shù)方面均能產(chǎn)生與原料阿膠相似的效果.

表1 小鼠免疫器官指數(shù)測定結(jié)果

注：與空白對照組相比，A.P<0.01，B.P<0.05，C.P>0.05，與陽性對照組相比，c.P>0.05.

2.2 阿膠泡騰片對小鼠碳廓清指數(shù)的影響

用紫外-可見分光光度計(jì)在波長680 nm處測定各小鼠血樣的吸光度值，計(jì)算小鼠碳廓清指數(shù).結(jié)果如表2所示.

表2 小鼠碳廓清指數(shù)測定結(jié)果

注：與空白對照組相比，A.P<0.01，C.P>0.05,與陽性對照組相比，b.P<0.05，c.P>0.05.

由表2可見，灌胃原料阿膠及不同劑量阿膠泡騰片后，小鼠碳廓清指數(shù)均有不同程度增加.與空白對照組相比，阿膠泡騰片高劑量組及陽性對照組小鼠碳廓清指數(shù)具有極顯著差異(P<0.01)，但阿膠泡騰片低劑量組及中劑量組小鼠碳廓清指數(shù)的差異并不顯著(P>0.05).與陽性對照組相比，阿膠泡騰片低劑量組碳廓清指數(shù)有顯著差異(P<0.05)，阿膠泡騰片中劑量組及高劑量碳廓清指數(shù)均無顯著差異(P>0.05).表明中劑量和高劑量阿膠泡騰片在提高小鼠碳廓清指數(shù)方面具有與原料阿膠相似的效果.

2.3 阿膠泡騰顆片對小鼠足腫脹度的影響

按照上述方法試驗(yàn)后，用游標(biāo)卡尺測定小鼠足跖厚度，計(jì)算DTH值.結(jié)果如表3所示.

表3 小鼠DTH值測定結(jié)果

注：與空白對照組相比，A.P<0.01，B.P<0.05,與陽性對照組相比，c.P>0.05.

由表3可見，灌胃阿膠泡騰片和原料阿膠后，阿膠泡騰片各劑量組小鼠和陽性對照組小鼠DTH值均有不同程度增加.與空白對照組相比，阿膠泡騰片低劑量組、中劑量組小鼠DTH值均具有顯著差異(P<0.05)，而阿膠泡騰片高劑量及陽性對照組DTH值均存在極顯著差異(P<0.01).與陽性對照組相比，阿膠泡騰片各劑量組小鼠DTH值均未見顯著差異(P>0.05).表明所選用的阿膠泡騰片各劑量在提高小鼠足腫脹度方面均能產(chǎn)生與原料阿膠相似的效果.

3 結(jié)束語

阿膠為傳統(tǒng)經(jīng)典中藥，在我國應(yīng)用歷史已超過2 500多年.阿膠中主要成分是膠原蛋白.現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，阿膠具有補(bǔ)血、抗疲勞、提高機(jī)體免疫功能等多種功效.阿膠泡騰片是以傳統(tǒng)阿膠塊為主要原料，經(jīng)過現(xiàn)代特殊工藝技術(shù)研制而成的一種新劑型.為了明確阿膠泡騰片對機(jī)體免疫功能影響，本文以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以成人每日推薦阿膠使用量為基礎(chǔ)，根據(jù)阿膠泡騰片中阿膠實(shí)際含量，換算出小鼠等效劑量作為中等劑量，再擴(kuò)大到兩倍或縮小到兩倍分別作為高劑量及低劑量.本文所選用的陽性對照藥為原料阿膠塊，陽性對照藥的劑量與阿膠泡騰片高劑量的等效劑量相同.

胸腺為中樞免疫器官，脾臟為外周免疫器官.脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與機(jī)體免疫功能有直接關(guān)系，機(jī)體免疫功能在一定程度上會(huì)隨免疫器官指數(shù)上升而增強(qiáng).對小鼠灌胃阿膠泡騰片后，小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有所增加，表明阿膠泡騰片能夠不同程度促進(jìn)小鼠中樞和外周免疫器官發(fā)育，提高機(jī)體免疫功能，與原料阿膠具有相似的效果.

巨噬細(xì)胞吞噬能力可以反映機(jī)體的非特異性免疫功能.當(dāng)顆粒狀異物(如碳粒)靜脈注射進(jìn)入機(jī)體后，能迅速被巨噬細(xì)胞吞噬清除.此時(shí)，若將異物量恒定，測定異物在血液中被吞噬細(xì)胞消除的速率，就可以反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能[8].碳廓清試驗(yàn)結(jié)果顯示，給小鼠灌胃中劑量和高劑量阿膠泡騰片后，小鼠碳廓清指數(shù)明顯增加，提示使用與原料阿膠等效劑量或低于等效劑量的阿膠泡騰片，均能明顯提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力，增強(qiáng)小鼠非特異性免疫功能.

T淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答以及移植排斥反應(yīng)中起重要作用.T淋巴細(xì)胞在特異性免疫應(yīng)答中介導(dǎo)細(xì)胞免疫，包括遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng).雞血紅細(xì)胞作為半抗原注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)后，能與小鼠體內(nèi)蛋白結(jié)合成完全抗原，即可以刺激T淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞.當(dāng)一定濃度的雞血紅細(xì)胞混懸液被重新注射到小鼠足跖部位時(shí)，即可誘發(fā)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生局部遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，24～48h內(nèi)達(dá)到最高峰.遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，給小鼠灌胃阿膠泡騰片后，能不同程度的提高小鼠的DTH值.提示阿膠泡騰片能夠激發(fā)小鼠T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能.

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