吡格列酮對實驗性動脈粥樣硬化大鼠血脂水平的影響及臨床意義

蔡輝 董曉蕾 李蓉 趙凌杰 袁愛紅

高脂血癥是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病理發(fā)生發(fā)展的常見傳統(tǒng)危險因素之一，長期高脂飲食造成血脂水平增高會損傷血管內(nèi)皮功能，增加氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，促進泡沫細胞形成，還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡或壞死，加速AS的病理進程［1］。吡格列酮是人工合成型過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的高親和性配體激活劑，屬噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，因可以改善代謝和血管胰島素抵抗而廣泛用于2型糖尿病患者治療。近來研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮可阻止高脂飲食喂養(yǎng)的LDLR-/-小鼠早期AS病損發(fā)展［2］，這可能與其改善糖脂代謝、保護血管內(nèi)皮功能、減少炎性指標(biāo)、抑制平滑肌細胞增殖、抗血栓形成、穩(wěn)定斑塊等作用相關(guān)［3］。本實驗通過高脂飲食喂養(yǎng)大鼠，造成高脂血癥，構(gòu)建早期AS動物模型，并觀察吡格列酮對AS模型大鼠血脂改善情況和主動脈粥樣硬化病理改變，進一步完善吡格列酮的抗AS作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑實驗動物為健康的剛斷乳(21 d)Sprague Dawley(SD)雄性大鼠，清潔級，26只，體質(zhì)量(60±9)g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動物實驗中心提供［實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2003-0032］。配方高脂飲食飼料由上海斯萊克動物實驗中心提供，高脂飲食配方為：標(biāo)準(zhǔn)粉21%，麥麩皮7.1%，大豆粉12.6%，玉米粉12%，魚粉3%，豬油12%，蔗糖5%，雞蛋10%，花生5%，奶粉5%，麻油2%，酵母粉0.6%，食鹽2%，膽固醇2%，膽酸鹽0.5%，甲基硫氧嘧啶0.2%。鹽酸吡格列酮(15 mg/片)由杭州中美華東制藥提供(批號：081103)。三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。蘇木素染色液購自福州邁新公司。

1.2 高脂血癥大鼠模型的建立及分組干預(yù)選用26只SD雄性大鼠，均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為對照組(n=9)和高脂飲食組(n=17)，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組給予高脂飼料喂養(yǎng)，第12周末從眼眶后靜脈抽血化驗以確定模型是否復(fù)制成功。再將高脂飲食組大鼠隨機分為模型組(n=8)和吡格列酮組(n=9)，吡格列酮組給予吡格列酮10 mg/(kg·d)連續(xù)灌胃，對照組和模型組予蒸餾水(1.5 ml/100 g)灌胃，1次/d，均干預(yù)4周，干預(yù)同時繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)。模型組和吡格列酮組高脂飼料進食量控制在15 g/(100 g·d)，分早、中、晚三餐定時定量分別給予。

1.3 觀察指標(biāo)和方法實驗結(jié)束后，禁食24 h，于次日上午8時，用20%氯胺酮，以1 ml/100 g劑量麻醉后，剪開胸腹腔，暴露心臟，左心室穿刺取血5 ml，室溫靜置1 h后，3000 r/min離心5 min，分離血清置-20℃冰箱保存，待測血脂指標(biāo);于冰盤中迅速分離主動脈，剪一段2 cm長主動脈置10%中性甲醛固定液中固定，待主動脈組織病理學(xué)檢測。

1.3.1 血脂指標(biāo)檢測：按照試劑盒步驟檢測血脂，TG用TPO-PAP法，TC用CHOD-PAP法，HDL-C和LDL-C用選擇性沉淀法。

1.3.2 主動脈病理形態(tài)學(xué)觀察：大鼠主動脈弓與胸主動脈交界處取材，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，水平橫切面制備石蠟切片，厚度4 μm，蘇木素伊紅(HE)染色，光鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行統(tǒng)計。定量資料以ˉx±s表示，各組干預(yù)前后比較用配對樣本t檢驗;多組資料組間比較用單因素方差分析，方差齊性用LSD，方差不齊用Dunnett T3。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組干預(yù)前后血脂水平干預(yù)前，模型組和吡格列酮組之間血脂比較無顯著差異(P＞0.05)，而模型組、吡格列酮組和對照組比較TG、TC、LDL-C有顯著差異(P均＜0.01)。提示高脂血癥大鼠造模成功。干預(yù)后吡格列酮組TG、TC、HDL-C和LDL-C較前明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)，與模型組相比，吡格列酮組TC、TG顯著降低(P＜0.01)。而干預(yù)后模型組TC較干預(yù)前有所降低(P＜0.05)，TG、HDL-C、LDL-C較干預(yù)前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 干預(yù)前后各組大鼠血脂水平(±s，mmol/L)

表1 干預(yù)前后各組大鼠血脂水平(±s，mmol/L)

注：與對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，▲▲P＜0.01;各組干預(yù)后與干預(yù)前比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

指標(biāo)對照組(n=9)模型組(n=8)吡格列酮組(n=9)TG干預(yù)前0.929±0.1501.915±0.458＊＊1.564±0.444＊＊△△干預(yù)后0.780±0.1951.534±0.172＊＊0.731±0.319▲▲△△TC干預(yù)前1.831±0.2263.484±1.150＊＊2.528±0.321＊＊干預(yù)后1.690±0.3183.084±0.984＊＊△1.720±0.249▲▲△△HDL-C干預(yù)前1.255±0.0921.338±0.2051.371±0.203干預(yù)后1.187±0.1481.168±0.0651.204±0.206△LDL-C干預(yù)前0.195±0.0510.581±0.489＊＊0.426±0.072＊＊干預(yù)后0.153±0.0500.214±0.1240.230±0.079

2.2大鼠主動脈病理形態(tài)學(xué)對照組血管壁結(jié)構(gòu)清晰、內(nèi)皮細胞完整無脫落，內(nèi)膜完整而光滑，中膜平滑肌走行清晰、無增生、厚度正常，外層為疏松結(jié)締組織;模型組血管壁內(nèi)皮細胞部分脫落，內(nèi)膜增厚，血管壁向管腔內(nèi)突出，可見中膜平滑肌增生、排列紊亂;吡格列酮組血管內(nèi)皮基本完好，偶有脫落，平滑肌細胞增殖不明顯，排列規(guī)則，形態(tài)基本正常(圖1)。

圖1 各組主動脈病理形態(tài)(HE，×400)

3 討論

長期高脂飲食和血脂持續(xù)增高與多種心血管疾病密切相關(guān)，脂代謝異常包括血清中TG、TC和LDL-C的升高以及HDL-C的降低，是誘發(fā)AS的重要因素之一。大量研究顯示LDL與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)生呈正相關(guān)，尤其是氧化型LDL(ox-LDL)在粥樣斑塊形成及動脈彈性的改變過程中起著關(guān)鍵的作用。ox-LDL可以引起內(nèi)皮功能障礙，促進泡沫細胞形成和平滑肌細胞增殖，促進血管重塑，增加斑塊的易損性等［4］。TC水平的升高可直接損傷血管內(nèi)皮細胞，造成內(nèi)皮功能紊亂，導(dǎo)致一氧化氮生成減少，內(nèi)皮依賴血管擴張能力明顯下降，血管收縮［5］。高TG血癥通過產(chǎn)生小而密的LDL、降低HDL、促進凝血以及加強氧化修飾脂蛋白等途徑促進AS病理形成［6］。本實驗利用高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥模型大鼠，模型組干預(yù)前后血清TG、TC、LDL-C顯著高于對照組(P＜0.01)，且主動脈病理形態(tài)顯示有早期AS改變，如內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)不完整，部分脫落，平滑肌細胞增殖，內(nèi)膜增厚等。

他汀類藥物是調(diào)血脂治療領(lǐng)域中的主要藥物，能顯著降低TC、LDL-C水平，此外還有抗炎、保護血管內(nèi)皮功能等非降脂作用。他汀類藥物治療AS療效確切，但在升高HDL-C，降低TG和改善耐胰島素性方面作用較小。而近來大規(guī)模臨床試驗提示廣泛用于2型糖尿病患者治療的吡格列酮對心血管方面的保護作用，除了持久的降低血糖、改善胰島素敏感性作用外，還可改善血脂代謝，TG降低9.9%～12.3%，HDL-C增加18.1%～20.3%，LDL-C適當(dāng)升高約5.2%～9.6%［7-8］;并有研究報道吡格列酮治療可阻止高脂飲食喂養(yǎng)的LDLR-/-小鼠早期AS病損發(fā)展［2］，延緩2型糖尿病患者頸動脈內(nèi)膜-中層厚度進展，降低冠脈AS的發(fā)生率［9］。吡格列酮是高度選擇性、且作用很強的PPARγ激動劑，屬于噻唑烷二酮類胰島素增敏劑。相比其他PPARγ激動劑如曲格列酮有嚴(yán)重的肝臟毒性，羅格列酮長期服用可增加心絞痛或心肌梗死的風(fēng)險［10］，而吡格列酮激活PPARγ后表現(xiàn)出保護血管內(nèi)皮細胞功能、減少炎性指標(biāo)、抑制平滑肌細胞增殖、抗血栓形成、穩(wěn)定斑塊等作用，從而影響AS病理過程，可降低心血管事件的發(fā)生率和病死率［2，9］。

長期吡格列酮治療可改善TG和HDL-C水平，其作用獨立于降糖治療和他汀類應(yīng)用［8］。吡格列酮降低TG水平可能主要有以下原因［11-12］：抑制脂肪組織釋放游離脂肪酸;增加脂蛋白脂酶介導(dǎo)的脂解作用和血循環(huán)中極低密度脂蛋白的清除率;同時增加對載脂蛋白C-Ⅲ產(chǎn)生的抑制作用。大量研究證實吡格列酮可影響HDL顆粒大小和數(shù)量，可能與吡格列酮降低TG水平有關(guān)，最近報道吡格列酮可顯著增加HDL 2亞級，而不影響apo AI水平［12］，并有研究顯示吡格列酮對HDL水平的直接作用與脂聯(lián)素水平升高有一定相關(guān)性［13］。多變量分析顯示吡格列酮誘導(dǎo)的TG/HDL-C比例降低與粥樣斑體積百分數(shù)和總的粥樣斑塊體積改變顯著相關(guān)，可推遲糖尿病患者的粥樣斑塊進展［14］。

吡格列酮治療的患者LDL-C增加，與LDL向大顆粒轉(zhuǎn)變增加相關(guān)，LDL顆粒濃度降低［8］，并且相對于羅格列酮，吡格列酮治療更能有效增加大顆粒LDL濃度，降低影響AS發(fā)生發(fā)展的小而致密的LDL顆粒濃度［15］。另外PPARγ激活能導(dǎo)致B類清道夫受體CD36表達增加，促進ox-LDL進入細胞，但同時也使另一種參與LDL攝取的A類清道夫受體Ⅰ/Ⅱ表達下降，并能上調(diào)巨噬細胞中參與TC逆向轉(zhuǎn)運的基因表達如脂蛋白脂肪酶、肝X受體a、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1、載脂蛋白AⅠ等。提示吡格列酮可增強巨噬細胞中TC逆向轉(zhuǎn)運，抑制泡沫細胞形成，減少活化的巨噬細胞分泌炎性細胞因子，延緩AS進程［2，16］。

本實驗給予大鼠高脂飲食12周后，予以吡格列酮干預(yù)4周，與模型組相比，吡格列酮組TC、TG顯著降低(P＜0.01)，且干預(yù)后吡格列酮組TG、TC和LDL-C較前明顯降低(P＜0.01)，主動脈病理顯示血管內(nèi)皮基本完好，偶有脫落，平滑肌細胞增殖不明顯，排列規(guī)則，形態(tài)基本正常。以上結(jié)果顯示吡格列酮治療可調(diào)節(jié)血脂水平，改善影響AS發(fā)展的傳統(tǒng)危險因素，抑制主動脈早期AS病理改變，提示吡格列酮抗AS作用可能部分依賴于血脂改善作用。

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