耐甲氧西林金黃色葡萄球菌小鼠全身感染模型的建立與評(píng)價(jià)

王婷婷，左錢飛，劉開(kāi)云，廖亞玲，解慶華，鄒全明，曾浩

(第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室暨國(guó)家免疫生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶 400038)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是一種常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性致病菌，已成為社區(qū)獲得性感染和院內(nèi)感染的主要致病菌之一。MRSA 不但寄居于皮膚和黏膜表面，也能在多種組織及血液中生長(zhǎng)繁殖，引起多種疾病，如人和動(dòng)物的局部化膿性感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎，甚至引起菌血癥、敗血癥、膿毒血癥等全身感染病癥［1］。MRSA 感染與乙型肝炎、AIDS并稱為當(dāng)今世界三大感染性疾?。?］。對(duì)常規(guī)抗生素的耐藥使得MRSA 治療困難并且費(fèi)用昂貴［3］。因此，研究新的能夠有效對(duì)抗MRSA 的新藥非常必要。無(wú)論是新的抗生素，還是新的疫苗，在其研發(fā)過(guò)程中，都離不了動(dòng)物模型對(duì)其有效性和安全性的評(píng)估。建立一種易操作、成本低、實(shí)驗(yàn)結(jié)果再現(xiàn)性好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，能為新藥研發(fā)及療效觀察提供參考依據(jù)，也對(duì)系統(tǒng)研究MRSA 感染的發(fā)病機(jī)制及其防治策略具有重要意義［4］。為此，我們采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株MRSA252，經(jīng)尾靜脈注射感染途徑，成功建立了MRSA 小鼠全身感染模型，并從生存率和體重變化、血液及主要器官細(xì)菌定植量及主要器官病理改變?nèi)齻€(gè)方面對(duì)模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c 小鼠，SPF 級(jí)，雌性，6～8 周齡，體重18～20 g，來(lái)源于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009－0004】。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合實(shí)驗(yàn)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)【SYXK(渝)2007－0013】進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到第三軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)，符合中國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的福利倫理準(zhǔn)則，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 菌株

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株MRSA－252，購(gòu)自美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)(American Tissue Culture Collection，ATCC)。

1.2 方法

1.2.1 感染用菌株的培養(yǎng)與制備

復(fù)蘇國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株MRSA－252，劃線接種于MH平板，37℃培養(yǎng)18 h，挑取單個(gè)菌落，接種于MH 液體培養(yǎng)基中，37℃，適當(dāng)轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)6～8 h，離心后棄上清，再以無(wú)菌生理鹽水洗滌2 次，最后以無(wú)菌生理鹽水重懸菌體，測(cè)定其在600 nm 處的吸光度(A600)。根據(jù)以往實(shí)驗(yàn)所得A600－CFU 標(biāo)準(zhǔn)曲線，調(diào)整菌液濃度約為5.0 × 1010CFU/mL、1.0 × 1010CFU/mL、5.0 ×109CFU/mL 及1.0 ×109CFU/mL。

1.2.2 小鼠模型的建立

將小鼠隨機(jī)分為五組，每組10 只。其中實(shí)驗(yàn)組4 組，對(duì)照組1 組。所有小鼠提供充足的飼料和飲水。實(shí)驗(yàn)組小鼠(第I、II、III、IV 組)分別經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL 洗滌后的菌液(菌液濃度分別為5.0 ×1010CFU/mL、1.0 ×1010CFU/mL、5.0 ×109CFU/mL及1.0 ×109CFU/mL)，對(duì)照組小鼠經(jīng)尾靜脈注射等量無(wú)菌生理鹽水。

1.2.3 模型的評(píng)價(jià)

(1)生存率及體重變化

感染前，稱量各組小鼠體重。感染后，每天稱量小鼠的體重1 次，不同時(shí)段觀察小鼠的生存狀況，直至感染后第10 天。根據(jù)所觀察測(cè)量的數(shù)據(jù)，繪制小鼠感染后10 d 的生存曲線，并分析感染組與對(duì)照組小鼠的體重變化情況。

(2)血液及多臟器MRSA 定植量的測(cè)定

小鼠感染后，每天同一時(shí)段分別從感染組和對(duì)照組中隨機(jī)取2 只小鼠，無(wú)菌條件下取血液鋪板計(jì)數(shù)細(xì)菌，同時(shí)無(wú)菌取腎臟、脾臟、肝臟全器官，用玻璃勻漿器磨碎后鋪板計(jì)數(shù)細(xì)菌。

(3)病理學(xué)檢查

無(wú)菌條件下取死亡小鼠脾臟、腎臟、肝臟、心臟、肺臟，浸泡于4% 甲醛溶液中。同時(shí)隨機(jī)取對(duì)照組兩只小鼠，做同樣處理。標(biāo)本送第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科做病理切片，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生存率及體重變化

第I 組小鼠在接種后表現(xiàn)出精神狀況差、厭食、鼠毛蓬松，小鼠體重明顯下降，48 h 內(nèi)10 只小鼠全部死亡。第II 組小鼠精神狀況較差、厭食、鼠毛蓬松，體重下降，48 h 內(nèi)死亡3 只，第6 天體重開(kāi)始稍上升。第III 組小鼠精神狀況稍差，感染后體重下降，從感染后第6 天開(kāi)始小鼠體重又開(kāi)始上升，第8天后體重明顯上升，整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察階段，無(wú)小鼠死亡。第IV 組小鼠精神狀況尚可，體重?zé)o明顯變化，感染第6 天開(kāi)始小鼠體重明顯上升，無(wú)小鼠死亡。對(duì)照組小鼠精神食欲無(wú)異常，體重變化不大。生存曲線和體重變化如圖1、圖2 所示。

2.2 血液及多臟器MRSA 定植量的測(cè)定

如圖3～6 所示:各感染組小鼠感染后血液及肝、脾、腎組織中均有細(xì)菌定植，且在感染后第三天細(xì)菌定植量達(dá)到高峰。在各感染組中，第II 組小鼠細(xì)菌定植量最多，第IV 組小鼠細(xì)菌定植量最少。對(duì)照組小鼠血液及各臟器中均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

圖1 小鼠生存曲線Fig.1 The survival curves of mice from different groups

圖2 小鼠體重變化Fig.2 Changes of body weight of the mice

圖3 感染后不同時(shí)間血液細(xì)菌定植量Note:Because at some time points，the numbers of colonies were too much to count，so we used 8 to represent Lg CFU at these time points.Fig.3 Bacterial loads of the blood at different time points after infection

2.3 病理學(xué)檢查

圖4 感染后不同時(shí)間肝臟細(xì)菌定植量Note:Because at some time points，the numbers of colonies were too many to count，so we used 8 to represent Lg CFU at these time points.Fig.4 Bacterial loads of the liver at different time points after infection

圖5 感染后不同時(shí)間脾臟細(xì)菌定植量Note:Because at some time points，the numbers of colonies were too many to count，so we used 8 to represent Lg CFU of these time points.Fig.5 Bacterial loads of the spleen at different time points after infection

圖6 感染后不同時(shí)間腎臟細(xì)菌定植量Note:Because at some time points，the numbers of colonies were too many to count，so we used 8 to represent Lg CFU at these tome points.Fig.6 Bacterial loads of the kidney at different time points after infection

感染組小鼠表現(xiàn)出明顯的組織病理學(xué)變化(見(jiàn)圖7 A－D):心肌纖維斷裂并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);肝細(xì)胞體積增大出現(xiàn)氣球樣變并伴有局灶性細(xì)胞壞死，匯管區(qū)可見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞分布;肺泡及間質(zhì)中可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);腎間質(zhì)充血、局部腎小管上皮細(xì)胞變性壞死。對(duì)照組小鼠的心臟、肝、肺和腎等組織中細(xì)胞排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7 見(jiàn)彩插10)。

圖7 MRSA 感染小鼠的組織病理學(xué)變化（HE 染色）Note: A.Heart ;B.Liver;C.Lung;D.KidneyFig.7 Histopathological changes of infected mice(HE staining)

3 討論

MRSA 感染比其他細(xì)菌感染要嚴(yán)重得多，并且可威脅患者生命［5］。借鑒人類與傳染病作斗爭(zhēng)的經(jīng)驗(yàn)，MRSA 疫苗將會(huì)是預(yù)防和治療MRSA 感染、大幅度降低MRSA 相關(guān)性疾病發(fā)病率的有效途徑，而建立一個(gè)易操作的MRSA 動(dòng)物感染模型是開(kāi)展上述研究工作的重要基礎(chǔ)。

與家兔、大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，小鼠的飼養(yǎng)管理方便、實(shí)驗(yàn)操作更為簡(jiǎn)單容易。BALB/c 小鼠對(duì)感染高度易感，并在細(xì)菌接種后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)癥狀［6］。MRSA－252 與其他MRSA 菌株相比，基因背景清楚且毒力較弱，更適合用于構(gòu)建動(dòng)物模型。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇MRSA252 感染BALB/c小鼠以構(gòu)建動(dòng)物模型。

目前國(guó)內(nèi)外建立的MRSA 小鼠感染模型主要有以下三種:膿毒血癥模型［7］、局部損傷模型［8］及肺部感染模型［9］。膿毒血癥是細(xì)菌全身感染發(fā)展的終末階段，目前仍是臨床感染性疾病加重乃至死亡的主要原因。細(xì)菌全身感染表現(xiàn)為細(xì)菌存在于血液中并可釋放毒素，主要組織器官有細(xì)菌定植并出現(xiàn)相應(yīng)病理改變，是細(xì)菌感染擴(kuò)散的結(jié)果。由于動(dòng)物全身感染模型各項(xiàng)指標(biāo)改變明顯、易檢測(cè)，且常導(dǎo)致一定數(shù)量小鼠死亡，因此能夠更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)疫苗效果。

本研究中，我們采用尾靜脈注射途徑建立的小鼠全身感染模型，具有組內(nèi)差異小、組間差異明顯、結(jié)果重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)為感染后小鼠生存率和體重下降，小鼠的血液及肝、脾、腎中有細(xì)菌定植，同時(shí)在心、肺、肝和腎等主要臟器中有較明顯的細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，符合全身感染的病理改變，表明經(jīng)此途徑建立的MRSA 小鼠全身感染模型是成功的。

綜上所述，我們用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株MRSA252，經(jīng)尾靜脈注射感染方法，成功建立了MRSA 小鼠全身感染模型。該動(dòng)物模型能夠全程監(jiān)測(cè)全身感染發(fā)病的時(shí)相性過(guò)程，且具有動(dòng)物來(lái)源方便、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，適用于MRSA 全身感染的發(fā)病機(jī)制和藥物療效及疫苗保護(hù)作用的研究等。該模型的建立，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究MRSA 疫苗的有效性和安全性提供可靠的技術(shù)手段。

(本文圖7 見(jiàn)彩插10)

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