金黃色葡萄球菌反向線性雜交探針檢測(cè)方法的建立

韋莉，魏立雯，賴國(guó)旗，譚毅，張文露，潘永全

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶 400016;2.感染性疾病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

金黃色葡萄球菌是一種人獸共患病病原體，屬于革蘭陽(yáng)性球菌，廣泛存在于自然界，可以引起人和其他動(dòng)物的各種疾病，如，化膿性關(guān)節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、蜂窩織炎、骨髓炎等［1］，臨床表現(xiàn)以呼吸道、皮膚、軟組織感染為主。金黃色葡萄球菌感染，將嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果［2］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究中四要素之一，我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物控制國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定，嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)不能攜帶金黃色葡萄球菌，因此在引種、飼養(yǎng)和繁殖過(guò)程中，必須定期對(duì)嚙齒類SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測(cè)，以保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作人員的健康。目前，檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法有很多，如國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T14926.14－2001(以下簡(jiǎn)稱GB 方法)、PCR 方法等［3］。GB 方法比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而PCR 方法的假陽(yáng)性又較高。本文根據(jù)反向線性雜交原理，建立金黃色葡萄球菌反向線性雜交探針檢測(cè)方法，用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

腸道菌總DNA 抽提試劑盒(上海華舜生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，質(zhì)粒提取試劑盒(道普生物科技(北京)有限公司，中國(guó))，堿性磷酸酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，pMD18－T Vector 試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司，中國(guó))，生物素抗體－堿性磷酸酶(AP)(Roche 公司，瑞士)，硝酸纖維膜(Millpore 公司，美國(guó))。S1000TM Thermal cycler PCR 儀和凝膠成像儀(BioRad 公司，美國(guó))，3100 測(cè)序儀(ABI 公司，美國(guó))，XYZ3050F劃膜儀(Biodot 公司，美國(guó))。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株25923、沙門菌、鏈球菌、大腸埃希氏菌、綠膿桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌由重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系提供，大腸桿菌E.coli DH5α 由本室保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

42 只清潔級(jí)KM 小鼠和32 只清潔級(jí)SD 大鼠，雌雄各半，體重20～22 g，來(lái)源于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物中心【SCXK(渝)2007－0001】。實(shí)驗(yàn)是在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)屏障環(huán)境中進(jìn)行【SYXK(渝)2007－0001】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 方法

1.2.1 通用引物與特異性探針設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 中公開(kāi)發(fā)表的金黃色葡萄球菌nuc 基因序列(GenBank:NC_002758.2)，設(shè)計(jì)如下一對(duì)通用引物［4］及特異性探針:

NucF1: 5′－Bio－GCCGAATTCGTTATGACAGAATACT－3′

Nuc R1:5′－Bio－CAAGTCGACCAGCGTTGTCTTCGC－3′

探針1:5′－GCCATACATATGCCAGC－3′

探針2:5′－CACTTGCTTCAGGACCA－3′

1.2.2 感受態(tài)制備

將DH5 α 菌液冰上放置10 min，分裝至1.5 mL EP 管，每管1 mL;4℃，4000 g 離心10 min。棄掉上清液，加入600 μL 氯化鈣，重懸細(xì)胞沉淀，4℃，4 000 g 離心10 min，棄掉上清液，加入40 μL 氯化鈣，重懸細(xì)胞沉，每管100 μL，置－80℃保存。

1.2.3 T 載體連接及轉(zhuǎn)化

pMD18－T vector 1 μL，PCR 產(chǎn)物2 μL，蒸餾水2 μL，solution I 5 μL。全量加入100 μL 感受態(tài)，冰中放置30 min，42℃加熱45 s，冰中放置1 min，加890 μL LB 液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min，1h。將菌液離心后，于氨芐抗性的培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h，篩選菌落并按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。

1.2.4 PCR 擴(kuò)增

在50 μL 反應(yīng)體系中分別加入PCR Premix 25 μL Nuc F1、Nuc R1 引物各1 μL，(25 μmol/L)，模板DNA 2 μL，滅菌超純水21 μL，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min;94℃45 s，62℃30 s，72℃45 s，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。

1.2.5 雜交膜的制備

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋成3 ng/μL，將Nuc F1、探針1、探針2 配制成50 μmol/L，用劃膜儀按PCR產(chǎn)物、生物素標(biāo)記的引物、探針1、探針2 順序線性噴灑于硝酸纖維膜上(圖1)，膜片經(jīng)紫外交聯(lián)后，120℃烘烤30 min，室溫干燥保存。

1.2.6 雜交條件優(yōu)化

按雜交膜的制備方法將兩條3′、5′端用不同bp dC(10C、15C、20C)對(duì)稱修飾的探針制備反向線性雜交試紙條，試紙條浸泡在2 mL 45℃預(yù)熱的雜交液(6 ×SSC，0.1% SDS)中，加入20 μL PCR 變性產(chǎn)物(10 μL 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物、10 μL 變性液，室溫混合處理10 min)，37℃，40℃或43℃雜交30 min，60 min 或120 min。

1.2.7 洗膜和顯色

雜交完成后，用雜交液室溫漂洗2 min，洗脫液(0.5 × SSC，0.1% SDS)50℃洗脫30 min，TBS 室溫漂洗5 min。將膜片浸泡于2 mL 生物素抗體堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)溶液(含TTBS 2 mL、BSA 0.1g、AP0.4 μL)中，28℃30 min，然后用TBS 室溫漂洗5 min，顯色緩沖液25℃洗膜5 min。最后將膜浸入2 mL NBT/BCIP 顯色液(顯色緩沖液2 mL，NBT/BCIP 40 μL)中，28℃避光顯色30 min，蒸餾水終止反應(yīng)，根據(jù)紫色線條出現(xiàn)的位置和順序直接判斷結(jié)果。

1.2.8 雜交特異性及靈敏性檢測(cè)

雜交特異性:分別提取金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株25923、沙門菌、鏈球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌基因組DNA，用制備好的反向線性探針試紙條進(jìn)行雜交并顯色，分析檢測(cè)結(jié)果。

雜交靈敏性:將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物按200、20、2、0.2 ng/μL 進(jìn)行稀釋，用制備好的反向線性探針試紙條進(jìn)行雜交并顯色，分析檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)。

1.2.9 臨床樣本檢測(cè)

用新建立的反向探針?lè)椒ê虶B 方法同時(shí)檢測(cè)42 只清潔KM 小鼠和32 只SD 大鼠。分析兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 11.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)，即為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nuc 基因的擴(kuò)增

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株25923PCR 產(chǎn)物經(jīng)T載體克隆后，篩選陽(yáng)性克隆，于氨芐抗性的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 h，進(jìn)行菌液PCR 擴(kuò)增，在678 處可見(jiàn)陽(yáng)性條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。經(jīng)過(guò)測(cè)序，其結(jié)果與NCBI 中的序列一致。

圖1 nuc 基因DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Note:The nuc was inserted into T vecter，and the bacteria DNA was assessed by PCR.The DNA amplification products were 678 bp as expected.M:1000 bp marker;1～15:PCR products.Fig.1 Agarose gel electrophoresis of amplification products of the nuc gene

2.2 雜交條件優(yōu)化

將兩條探針的3′、5′端對(duì)稱用不同bp 的dC 修飾(10 C、15 C、20 C)，在3 個(gè)溫度(37℃、40℃、43℃)下雜交不同時(shí)間(0.5、1、2 h)，在28℃條件下與不同的AP 抗體濃度(1 ∶15 000、1 ∶10 000、1∶5 000)結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15C 修飾的探針、雜交溫度為37℃、雜交時(shí)間60 min、抗體濃度為1∶5000 信號(hào)強(qiáng)度最好，且無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)。

2.3 雜交檢測(cè)的特異性

應(yīng)用建立的反向線性雜交方法，檢測(cè)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株25923、沙門菌、鏈球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌基因組DNA，雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有試紙條的顯色對(duì)照和通用引物均為陽(yáng)性顯色，金黃色葡萄球菌25923 探針1 和探針2 出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性顯色，而其他菌株雜交結(jié)果均為陰性(圖2)。

2.4 雜交檢測(cè)的靈敏性

用制備好的試紙條檢測(cè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物，PCR 產(chǎn)物濃度為2 ng/μL 時(shí)，能被檢出(圖3)。

圖2 金黃色葡萄球菌反向線性雜交特異性檢測(cè)Note:1.PCR products of SA hybridization;2－9.PCR products of hybridization of Sarmonella，Streptococcus，E.coli，Pseudomonas aeruginosa，Proteus，dysentery bacilli，Bacillus subtilis，Staphylococcus epidermidis;10.Negative control.Fig.2 Specificity of RLH detection of Staphylococcus aureus

2.5 臨床樣本檢測(cè)

應(yīng)用本文建立的反向雜交探針的方法與GB 方法(見(jiàn)圖4，彩插10)同時(shí)對(duì)清潔級(jí)小鼠和大鼠進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法結(jié)果完全一致，均為陰性，P ＞0.5，差異無(wú)顯著性。

圖3 金黃色葡萄球菌反向線性雜交靈敏度檢測(cè)Note:1:20 ng/μL，2:2 ng/μL，3:0.2 ng/μL;4:0.02 ng/μLFig.3 Sensitivity of reverse linear hybrid detection of Staphylococcus aureus

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是經(jīng)人工飼育，對(duì)其攜帶的微生物、寄生蟲(chóng)實(shí)行控制，遺傳背景明確或者來(lái)源清楚的，用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、檢定及其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物，是生物醫(yī)學(xué)研究中的“活試劑”。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量好壞，將嚴(yán)重影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生金黃色葡萄球菌的感染，其產(chǎn)生的腸毒素將會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生化指標(biāo)產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定?？焖?，特異、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)金黃色葡萄球菌，對(duì)保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量具有重要意義。

在我國(guó)GB149242－2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)采用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法，這是檢測(cè)金黃色葡萄球菌的金標(biāo)準(zhǔn)，其檢測(cè)過(guò)程包括采樣、菌落鑒定等，操作復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力。

反向雜交技術(shù)又名基因探針技術(shù)或核酸分子雜交技術(shù)，其原理是在已知的引物片段上加上可識(shí)別的標(biāo)記(如同位素標(biāo)記、生物素標(biāo)記)，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使PCR 產(chǎn)物與核酸探針雜交，用以檢測(cè)未知樣品是否具有與其相同的序列［5］。近年來(lái)，Candice等［6］已經(jīng)將反向線性探針的方法用于病原微生物的檢測(cè)，取得了一定的成就。

nuc 基因序列是編碼耐熱核酸酶的基因，為金黃色葡萄球菌所特有，而且在不同菌株之間具有較高的保守性［7］。本文根據(jù)nuc 基因序列設(shè)計(jì)通用引物及特異性探針，擴(kuò)增目的片段，建立了反向線性探針檢測(cè)的方法。該方法與GB 方法比較，本方法快速，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需1 d 時(shí)間，GB 方法至少需要2～3 d;經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR 產(chǎn)物系列稀釋檢測(cè)和不同菌株的PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)，其檢測(cè)限為2 ng/μL，檢測(cè)特異性為100%。表明該方法檢測(cè)靈敏度高，特異性好。同時(shí)，通過(guò)對(duì)74 只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)分離方法一致，其準(zhǔn)確性為100%。本方法克服了GB 方法操作繁瑣、耗時(shí)、費(fèi)力和檢出率低等缺點(diǎn)。與PCR 比較，本方法結(jié)果判斷依據(jù)為:在顯色控制及通用引物均顯色的情況下，如果一條探針顯色為陽(yáng)性，則其結(jié)果判為可疑;如果兩條探針顯色為陽(yáng)性，則其結(jié)果判為陽(yáng)性，避免了PCR 檢測(cè)方法假陽(yáng)性的不足。同時(shí)，本文采用無(wú)放射性危險(xiǎn)的生物素將探針進(jìn)行標(biāo)記，較為安全可靠，且顯色效果好，克服了用放射性同位素標(biāo)記的核酸探針雖然靈敏度高，但存在放射性危害、價(jià)格昂貴、半衰期短和不穩(wěn)定等不足。

本研究所建立的反向探針線性雜交方法具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，檢測(cè)結(jié)果簡(jiǎn)潔、直觀，操作時(shí)無(wú)放射性污染，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的引種、飼養(yǎng)和繁殖過(guò)程中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)提供了一種快速、敏感、特異、安全和經(jīng)濟(jì)的新的檢測(cè)手段。

(本文圖4 見(jiàn)彩插10)

圖4 傳統(tǒng)方法對(duì)金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果Note: A.The growth of SA in SP(mannitol and sodium chloride agar medium);B.The growth of SA in blood agar(alpha hemolysis);C.Gram staining(Gram-positive cocci);D.Gas production in mannitol mediumFig.4 Detection results of Staphylococcus aureus by traditional methods

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