替米沙坦改善糖尿病大鼠腎臟功能機(jī)制研究

張茜，肖新華，黎明，李文慧，李偉，于淼，張化冰，平凡，孫曉方，茅李莉，楊國(guó)華

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科，衛(wèi)生部?jī)?nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100730)

替米沙坦(Telmisartan)是一種血管緊張素受體阻斷劑(ARB)類降壓藥，其還具有PPAR-γ 部分激動(dòng)劑的功能。近年研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦能保護(hù)2 型糖尿病患者腎臟功能。Benndorf 等［1］發(fā)現(xiàn)替米沙坦能改善正常蛋白尿的2 型糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞功能。Bakris 等［2］發(fā)現(xiàn)替米沙坦能減少大量蛋白尿2 型糖尿病患者尿蛋白。但是，有關(guān)替米沙坦改善糖尿病患者腎臟功能機(jī)制的研究，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面寥寥無(wú)幾?；蛐酒夹g(shù)作為一種先進(jìn)的高通量檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏、準(zhǔn)確、高信息量等優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)個(gè)體生物的大量基因表達(dá)信息進(jìn)行高速、并行采集和分析。本研究旨在觀察替米沙坦對(duì)糖尿病大鼠24 h 尿蛋白、肌酐清除率(Ccr)、血肌酐和血尿素氮(BUN)的影響，并且使用基因芯片技術(shù)來(lái)探討替米沙坦改善糖尿病大鼠腎功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理

SPF 級(jí)雄性Sprague-Dawley 大鼠，體重(230.7 ±11.2)g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2011-0010】，飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施【SYXK(京)2010-0028】。適應(yīng)72 h 后，10 只大鼠為正常對(duì)照組(給予等體積生理鹽水)，另20 只大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ，60 mg/kg，Sigma 公司，美國(guó))。注射1 周后，測(cè)隨機(jī)血糖高于16.7 mmol/L 者入選。將糖尿病造模成功的16只大鼠隨機(jī)分為替米沙坦治療組(每日給予10 mg/kg/d 替米沙坦溶液，柏林格殷格漢藥廠，德國(guó))和糖尿病模型組(給予等體積生理鹽水)，每組8 只。每天灌胃一次，每次每只灌胃1.5 mL，持續(xù)12 周。

1.2 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

于開(kāi)始灌胃當(dāng)天，喂藥后4、8、12 周測(cè)量大鼠體重、空腹血糖(FBG，禁食4 h 尾部取血，葡萄糖氧化酶法)。灌胃后12 周末留取大鼠24 h 尿，磺柳酸法測(cè)定24 h 尿蛋白，酶法測(cè)定尿肌酐。而后，禁食4 h，處死，摘眼球取血，酶法測(cè)定血肌酐和血尿素氮(BUN)。計(jì)算肌酐清除率(Ccr)，Ccr =(尿肌酐 ×每分鐘產(chǎn)生的尿體積)/(血肌酐 × 體重)。

1.3 大鼠腎臟基因芯片實(shí)驗(yàn)

1.3.1 腎臟組織總RNA 抽提處死大鼠后，立即取腎臟組織置液氮凍存?zhèn)溆谩Ｌ婷咨程菇M和糖尿病模型組各取3 個(gè)樣本。TRIZOL 法提取RNA。紫外吸收測(cè)定法和變性瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA 含量和質(zhì)量進(jìn)行鑒定。

1.3.2 合成cDNA

總RNA 逆轉(zhuǎn)錄得到單鏈cDNA。

1.3.3 大鼠基因表達(dá)譜芯片

本研究應(yīng)用大鼠基因芯片(Illumina RatRef-12表達(dá)譜芯片，美國(guó))，其包括22 524 個(gè)探針，覆蓋22 228個(gè)大鼠基因。該芯片廣泛應(yīng)用于基因功能研究，疾病與正常的基因表達(dá)差異研究，發(fā)病機(jī)制研究，藥物靶點(diǎn)研究等方面。具有低樣本輸入量(僅需50～200 ng RNA)，高重復(fù)性，高特異性，高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。將cDNA 稀釋后加入芯片雜交(58℃，18.5h)，隨后，洗滌，Cy3-鏈霉親和素染色。使用Illumina 芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)。

1.4 Real time PCR

為驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果，選取3 個(gè)基因進(jìn)行real time PCR 試驗(yàn)。引物見(jiàn)表1。設(shè)置程序如下:30 min 48℃，15 min 95℃，15 sec 95℃(40 個(gè)循環(huán))，1 min 55℃。ΔCt(cycle threshold)法［3］計(jì)算結(jié)果，具體如下:計(jì)算替米沙坦組和糖尿病模型組中的每個(gè)基因的ΔCt 值，相減得到每個(gè)基因的ΔΔCt 值。通過(guò)2－ΔΔCt計(jì)算兩組對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)差異。管家基因?yàn)镚apdh。Fold-change 值的絕對(duì)值＞2，而且P 值＜0.05 的基因?yàn)榫哂酗@著差異。

表1 Real-time PCR 引物設(shè)計(jì)Tab.1 Oligonucleotide sequences for primers used in the real-time PCR analysis

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 替米沙坦對(duì)糖尿病大鼠體重、FBG、24 h 尿蛋白、血肌酐、Ccr 和BUN 的影響

在給予替米沙坦前(0 周)正常對(duì)照組、糖尿病模型組和替米沙坦組體重?zé)o顯著差異。給予替米沙坦4、8 和12 周，替米沙坦組和糖尿病模型組較正常對(duì)照組體重顯著降低(其中4 周P＜0.05，8、12 周P＜0.01)。替米沙坦組較糖尿病模型組體重?zé)o顯著差異(表2)。在給予替米沙坦前(0 周)及給予替米沙坦4、8 和12 周替米沙坦組和糖尿病模型組FBG較正常對(duì)照組持續(xù)顯著升高(P＜0.01)。替米沙坦組較糖尿病模型組FBG 無(wú)顯著差異(表3)。提示替米沙坦不能改善糖尿病大鼠體重和血糖。給予替米沙坦12 周后，糖尿病模型組24 h 尿蛋白、血肌酐和BUN 水平較正常對(duì)照組顯著升高(其中血肌酐P＜0.05，24 h 尿蛋白和BUN P＜0.01)，Ccr 水平顯著降低(P＜0.01)。替米沙坦組24 h 尿蛋白、血肌酐和BUN 水平較糖尿病模型組顯著降低(其中血肌酐P＜0.05，24 h 尿蛋白和BUN P＜0.01)，Ccr 水平顯著升高(P＜0.05，表4)。提示替米沙坦具有改善糖尿病大鼠腎臟功能的作用。

表2 替米沙坦治療12 周大鼠體重(g，±s)Tab.2 Effects of telmisartan on the rat body weight(g，±s)

表2 替米沙坦治療12 周大鼠體重(g，±s)Tab.2 Effects of telmisartan on the rat body weight(g，±s)

注:與正常對(duì)照組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01。Note:Compared with the control group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01.

組別Groups0 周0 week4 周4 weeks8 周8 weeks12 周12 weeks正常對(duì)照組(n =10)Control246.6 ±18.3262.4 ±17.0273.4 ±10.1292.6 ±19.9糖尿病模型組(n =8)Diabetic250.0 ±12.8255.8 ±12.4*252.8 ±10.0＊＊259.2 ±12.7＊＊替米沙坦組(n =8)Telmisartan257.6 ±14.9261.2 ±12.1*255.9 ±11.6＊＊260.8 ±12.4＊＊

表3 替米沙坦治療12 周大鼠空腹血糖(mmol/L，±s)Tab.3 Effects of telmisartan on fast blood glucose in the rats(mmol/L，±s)

表3 替米沙坦治療12 周大鼠空腹血糖(mmol/L，±s)Tab.3 Effects of telmisartan on fast blood glucose in the rats(mmol/L，±s)

注:與正常對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01。Note:Compared with the control group，＊＊P＜0.01.

組別Groups0 周0 week4 周4 weeks8 周8 weeks12 周12 weeks正常對(duì)照組(n =10)Control6.5 ±0.66.3 ±0.76.4 ±0.56.7 ±0.3糖尿病模型組(n =8)Diabetic19.6 ±3.4＊＊18.9 ±4.1＊＊19.2 ±5.3＊＊19.4 ±6.0＊＊替米沙坦組(n =8)Telmisartan19.9 ±3.7＊＊18.7 ±3.4＊＊18.5 ±4.9＊＊19.2 ±4.6＊＊

表4 替米沙坦干預(yù)12 周后24 h 尿蛋白、血肌酐、肌酐清除率和尿素氮比較(±s)Tab.4 Effects of telmisartan on 24 h urinary albumin，blood creatinine，Ccr and BUN(±s)

表4 替米沙坦干預(yù)12 周后24 h 尿蛋白、血肌酐、肌酐清除率和尿素氮比較(±s)Tab.4 Effects of telmisartan on 24 h urinary albumin，blood creatinine，Ccr and BUN(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與糖尿病模型組比較，# P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with the control group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;Compared with the diabetic group，# P＜0.05，## P＜0.01.

組別Groups 24 h 尿蛋白24 h Urinary albumin(mg /d)血肌酐Blood creatinine(μmol/L)肌酐清除率Ccr(mL/min x per kg)尿素氮BUN(mmol/L)正常對(duì)照組Control(n =10)24.9 ±3.949.4 ±3.53.93 ±0.237.65 ±0.74糖尿病模型組Diabetic(n =8)72.6 ±5.4＊＊81.0 ±7.8*1.07 ±0.12＊＊20.29 ±2.57＊＊替米沙坦組Telmisartan(n =8)38.4 ±2.5*##60.5 ±6.2*#2.51 ±0.11*#10.95 ±1.15*##

2.2 基因芯片結(jié)果

替米沙坦組較糖尿病模型組有1541 個(gè)基因發(fā)生顯著改變，其中554 個(gè)上調(diào)，987 個(gè)下調(diào)。差異基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)7 個(gè)顯著改變的通路，包括:核糖體通路、氧化磷酸化通路、帕金森癥通路、三羧酸循環(huán)通路、丙酮酸代謝通路、PPAR 信號(hào)通路和糖酵解/糖異生通路(見(jiàn)表5)。

2.3 real time PCR 結(jié)果

替米沙坦組較糖尿病模型組ATP 合成酶β 亞基(Atp5b)、細(xì)胞色素c 氧化酶亞基Ⅵc(Cox6c)和NADH 脫氫酶(輔酶Q)鐵硫蛋白3(Ndufs3)分別下調(diào)1.257 倍，6.053 倍和2.109 倍(P＜0.05)，結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致(見(jiàn)表6)。ATP5B，COX6C 和NDUFS3 是線粒體氧化磷酸化通路上的重要蛋白?？梢?jiàn)，替米沙坦能抑制糖尿病大鼠線粒體氧化磷酸化。

表5 差異基因富集通路(FDR＜0.001，倍比值＞2.0)Tab.5 KEGG pathway(false discovery rate＜0.001，fold enrichment ＞2.0)

表6 Real time PCR 結(jié)果與基因芯片結(jié)果比較Tab.6 Comparison of the gene expression measured by real-time PCR and gene microarray analysis

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦能顯著降低糖尿病大鼠24 h尿蛋白、血肌酐和BUN，顯著升高Ccr。揭示替米沙坦能改善糖尿病大鼠腎臟功能。這與之前替米沙坦在其他2 型糖尿病患者中觀察到的療效是一致的［4，5］。

基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)替米沙坦組氧化磷酸化通路顯著改變。Real-time PCR 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)替米沙坦組Atp5b，Cox6c 和Nduf3 顯著下調(diào)。ATP5B，COX6C 和NDUFS3 是線粒體氧化磷酸化通路上的重要蛋白?？梢?jiàn)，替米沙坦能抑制糖尿病大鼠線粒體氧化磷酸化。線粒體是真核細(xì)胞生存和發(fā)揮功能的重要細(xì)胞器，它通過(guò)氧化磷酸化途徑產(chǎn)生機(jī)體內(nèi)大部分ATP，在形態(tài)上通過(guò)不斷的分裂和融合，從而維持動(dòng)力學(xué)平衡，并且是機(jī)體內(nèi)活性氧(ROS)生成的主要來(lái)源，在細(xì)胞凋亡及機(jī)體生長(zhǎng)和衰老等過(guò)程中起著十分關(guān)鍵的作用［6］。以往大量的研究表明，高糖引起的腎臟損害主要通過(guò)4 條生化途徑，即糖基化終末產(chǎn)物形成增加，蛋白激酶C 激活，多元醇通路活性增高和己糖胺途徑激活。然而這些途徑間的相互聯(lián)系和誘發(fā)因素尚不清楚［7］。Brownlee 等［8］提出了“統(tǒng)一理論”:認(rèn)為高糖環(huán)境下線粒體呼吸鏈過(guò)量產(chǎn)生的ROS 是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的啟動(dòng)因子，ROS 引起DNA 鏈斷裂，激活與DNA 修復(fù)有關(guān)的酶PARP(ADP-核糖多聚酶);PARP 通過(guò)改變修飾GAPDH抑制其活性，從而激活上述4 條生化途徑，而這些途徑也可進(jìn)一步引起ROS 的積聚，激活血管內(nèi)皮損傷通路，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和凋亡，從而造成多個(gè)器官的損傷。本研究提示替米沙坦可能通過(guò)抑制線粒體氧化磷酸化通路改善糖尿病大鼠腎臟功能。

另外，基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)替米沙坦組PPAR 信號(hào)通路顯著改變。替米沙坦是PPARγ 部分激動(dòng)劑。Nakamura 等［3］發(fā)現(xiàn)替米沙坦能通過(guò)激活PPARγ 受體，上調(diào)血管緊張素(1－7)受體MAS 表達(dá)，從而改善STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠氧化應(yīng)激和腎臟纖維化。另外，Yao 等［9］發(fā)現(xiàn)替米沙坦能通過(guò)激活PPARγ，抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的平滑肌中ACTIN 的表達(dá)和腎小球系膜細(xì)胞COLLAGEN-Ⅳ分泌。本研究揭示激活PPARγ 受體可能是替米沙坦改善糖尿病大鼠腎臟功能的機(jī)制之一。

總之，本研究觀察到替米沙坦能有效改善糖尿病大鼠腎功能。替米沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟功能的調(diào)節(jié)機(jī)制是多通路的，包括抑制線粒體氧化磷酸化通路，激活PPARγ 受體等。本研究嘗試使用基因表達(dá)譜芯片來(lái)探討這些復(fù)雜的機(jī)制。并且，本研究選用替米沙坦治療后的糖尿病大鼠的腎臟作為實(shí)驗(yàn)材料，為替米沙坦改善糖尿病大鼠腎臟功能的機(jī)制研究提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。當(dāng)然，這些結(jié)果還需要進(jìn)一步證實(shí)。

［1］Benndorf RA，Appel D，Maas R，et al.Telmisartan improves endothelial function in patients with essential hypertension［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2007，50(4):367－371.

［2］Bakris G，Burgess E，Weir M，et al.Telmisartan is more effective than losartan in reducing proteinuria in patients with diabetic nephropathy［J］.Kidney Int，2008，74(3):364－369.

［3］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(－ delta delta C(T))Method［J］.Methods，2011，25(4):402－408.

［4］Nakamura T，F(xiàn)ujiwara N，Sato E，et al.Renoprotective effects of various angiotensin II receptor blockers in patients with earlystage diabetic nephropathy［J］.Kidney Blood Pressure Res，2010，33(3):213－220.

［5］Makino H，Haneda M，Babazono T，et al.Microalbuminuria reduction with telmisartan in normotensive and hypertensive Japanese patients with type 2 diabetes:a post-hoc analysis of The Incipient to Overt:Angiotensin II Blocker，Telmisartan，Investigation on Type 2 Diabetic Nephropathy(INNOVATION)study［J］.Hypertension Res 2008，31(4):657－664.

［6］Westermann B.Mitochondrial fusion and fission in cell life and death［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2010，1l(12):872－884.

［7］肖力，孫林，劉伏友.糖尿病腎臟疾病蛋白尿形成機(jī)制新進(jìn)展［J］.中華腎臟病雜志，2010，26(6):478－480.

［8］Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism［J］.Diabetes，2005，54(6):1615－1625.

［9］Yao Y，Zou R，Liu X，et al.Telmisartan but not valsartan inhibits TGF-β mediated accumulation of extracellular matrix via activation of PPARγ［J］.J Huazhong Univ Sci Technol(Med Sci)，2008，28(5):543－548.