• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      鼠尾膠原蛋白提取、分離、純化方法的建立及鑒定

      2012-02-03 07:38:38任海濤鐘志勇鄭佳琳饒子亮鄺少松唐小江
      關(guān)鍵詞:酶法膠原蛋白氨基酸

      任海濤,鐘志勇,鄭佳琳,饒子亮,鄺少松,王 剛,唐小江

      (廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,佛山 528248)

      鼠尾膠原蛋白是膠原蛋白的一種,主要為Ⅰ型膠原蛋白[1]。Ⅰ型膠原蛋白主要存在于真皮、腱、骨、牙本質(zhì),以纖維形式形成膠原,由三股纏繞形成多肽鏈組[2]。作為一種新型生物材料,鼠尾膠原蛋白并不為眾人所知,但是其具有的諸多優(yōu)勢(shì),如低抗原性、生物可降解性、優(yōu)越的生物相容性并有利于細(xì)胞貼附和遷移等特點(diǎn)[3],為細(xì)胞增殖和功能分化提供了合適的微環(huán)境[4-5],且它來(lái)源廣泛,成分單一,制備比較方便,是開發(fā)具有相關(guān)功能性生物醫(yī)療器械的好材料[6]。

      目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)膠原蛋白提取、分離、純化主要有中性鹽法[7]、酸提取法[8-9]、堿提取法[6-10]、酶法[11-12]等,但中性鹽法、酸提取法、堿提取法方法均存在著提取得率低,且操作復(fù)雜,還可能破壞膠原蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)[13]。酶法應(yīng)用較廣,但仍存在著純化困難的問(wèn)題。迄今為止,還沒有針對(duì)鼠尾膠原蛋白進(jìn)行大規(guī)模制備的相關(guān)研究的報(bào)道。

      本研究的目的就是為了克服現(xiàn)有制備鼠尾膠原蛋白方法所存在的提取得率低、分離純化工藝復(fù)雜、沒有大規(guī)模生產(chǎn)方法等缺點(diǎn),提供一種工藝簡(jiǎn)單、提取得率和純度高的鼠尾膠原蛋白的制備方法。為大量獲得鼠尾膠原蛋白并進(jìn)行更深層次的功效研究提供理論支持和實(shí)踐基礎(chǔ)。

      1 材料和方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

      SD大鼠鼠尾,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2008-0002;使用許可證號(hào)SYXK(粵)2008-0002]。

      1.2 儀器與試劑

      835-50型氨裁酸自動(dòng)分析儀(日本Hitachi公司);J26XP大型冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司);Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀(美國(guó)BIORAD公司);130型制冰機(jī)(寧波新芝公司); MIKRO20離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司);萬(wàn)分之一天平(德國(guó)Sartorius公司);RH basic 2磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司);SRM-CD47醫(yī)用保存柜(日本Sanyo公司)。

      胃蛋白酶(Sigma公司);醋酸、氯化鈉(廣州中南化工公司)、萬(wàn)級(jí)透析袋(廣州威佳公司);Tris-HCl鹽、實(shí)驗(yàn)用水為18.2 mΩ超純水;其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

      1.3 實(shí)驗(yàn)方法

      本研究所采用的新型“酸混合酶”法通過(guò)對(duì)提取、分離、純化鼠尾膠原蛋白的單因素參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,得到了更優(yōu)的擴(kuò)大化生產(chǎn)工藝參數(shù)。首先,剝?nèi)D大鼠尾腱需按照“從細(xì)到粗”的原則,在冰浴上進(jìn)行,避免鼠尾膠原蛋白變性。同時(shí),應(yīng)將鼠尾軟骨在剝離前先自行擰成半斷裂狀,這樣可以最大限度的剝?nèi)∈笪搽?。再次,?duì)剝離的白色鼠尾腱應(yīng)立即放入含有0.05 mol/L Tris-HCl緩沖鹽的1 mol/ L NaCl溶液中處理24 h。以除去可溶性多糖、血液及其他雜質(zhì)等。提取鼠尾膠原蛋白的步驟如下:1.使用溶解有一定比例胃蛋白酶的酸溶液對(duì)初步處理的鼠尾腱進(jìn)行酶解,持續(xù)處理一段時(shí)間待混合物變成無(wú)色、透明、粘稠液體后即可在4℃,5000 g離心力下離心20 m in,收集上清即為粗制鼠尾膠原蛋白原液。2.將一定濃度的氯化鈉溶液加入其中,持續(xù)攪拌直至有白色絮狀沉淀從溶液中析出,繼續(xù)加入氯化鈉溶液至沉淀不在析出為止。4℃,5000 g離心力下離心20 m in后獲得白色沉淀。沉淀物加入一定濃度的酸溶液溶解。3、將溶解后的鼠尾膠原蛋白溶液繼續(xù)反復(fù)進(jìn)行鹽析處理,重復(fù)步驟2的過(guò)程2~4次。持續(xù)在超純水中透析3 d,每天換液3次以除去鼠尾膠原溶液中的無(wú)機(jī)鹽類,獲得的鼠尾膠原蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳、氨基酸含量分析儀的鑒定,純度好。4、通過(guò)建立起來(lái)的提取方法,繼續(xù)對(duì)提取單因素進(jìn)行了優(yōu)化:

      1.3.1 所用酸溶液的確定

      不同酸溶液可以對(duì)酶解產(chǎn)生不同的影響,比較稀鹽酸、醋酸、檸檬酸這3種酸溶液用于提取鼠尾膠原蛋白,每種酸溶液加入用于提取的鼠尾腱1 g,其他實(shí)驗(yàn)條件一致。3種酸溶液濃度均為0.05 mol/ L,持續(xù)4℃攪拌72 h。最終在0.05 mol/L濃度下的稀鹽酸、醋酸、檸檬酸提取條件下,分別獲得鼠尾膠原0.27 g、0.43 g、0.38 g。故選用醋酸溶液作為提取參數(shù)條件。

      1.3.2 所用酸溶液濃度的確定

      在2.2.1的優(yōu)化前提下,繼續(xù)對(duì)提取所用的酸溶液濃度進(jìn)行了優(yōu)化,選用了0.025 mol/L、0.05 mol/L、0.10 mol/L這3個(gè)濃度。每個(gè)濃度酸溶液加入用于提取的鼠尾腱1 g,其他實(shí)驗(yàn)條件一致。分別獲得鼠尾膠原0.37 g、0.44 g、0.38 g。故選用0.05 mol/L濃度作為提取參數(shù)條件。

      1.3.3 所用酶溶液濃度的確定

      在酸溶液中胃蛋白酶可以發(fā)揮良好的酶解效果,但綜合成本和得率考慮需要對(duì)酶溶液濃度進(jìn)行探討。本研究使用1∶10000胃蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn),使用配比分別為于50 m L 0.05 mol/L醋酸溶液溶解10 mg、50 mg、100 mg、200 mg,加入用于提取的鼠尾腱1 g,其他實(shí)驗(yàn)條件一致。分別獲得鼠尾膠原0.27 g、0.34 g、0.44 g、0.45 g??紤]到200 mg沒用量并沒有大幅度提供得率,故選用100 mg胃蛋白酶/50m L 0.05 mol/L醋酸溶液濃度(1∶500)作為提取參數(shù)條件。

      1.3.4 所用酶作用時(shí)間的確定

      時(shí)間是大規(guī)模生產(chǎn)上必須要考慮的一個(gè)問(wèn)題,本研究?jī)?yōu)化了酶解時(shí)間,分別選用酶解36 h、48 h、72 h、96 h,其他實(shí)驗(yàn)條件一致。每個(gè)提取時(shí)間加入用于提取的鼠尾腱1 g,獲得鼠尾膠原蛋白0.15 g、0.36 g、0.46 g、0.45 g。故選用酶解72 h作為提取參數(shù)條件。

      1.3.5 所用氯化鈉濃度的確定

      優(yōu)化了分級(jí)鹽析所用的氯化鈉濃度,分別選用1 mol/L、2 mol/L、4 mol/L,其他實(shí)驗(yàn)條件一致。每個(gè)提取時(shí)間配置用于提取的鼠尾腱1 g,獲得鼠尾膠原蛋白0.35 g、0.45 g、0.45 g。故選用2 mol/L作為提取參數(shù)條件。

      2 結(jié)果

      通過(guò)單因素條件優(yōu)化,獲得的最佳提取、分離、純化條件為:0.05 mol/L的醋酸,1∶500酶用量、酶解72 h、2 mol/L氯化鈉溶液分級(jí)鹽析。提高了提取鼠尾膠原蛋白的得率,為大批量生產(chǎn)鼠尾膠原蛋白打下了實(shí)踐基礎(chǔ),提供了理論支持。經(jīng)SDS-PAGE電泳和氨基酸含量分析的鑒定,獲得的鼠尾膠原蛋白純度高。本研究簡(jiǎn)化了提取工藝,每條大鼠鼠尾(總重)平均約5 g,可以提取到干重為200 mg的鼠尾膠原蛋白,提取得率約為4%左右。較傳統(tǒng)的方法提取得率僅為0.2%,提取得率提高了20倍以上。

      圖1 鼠尾膠原蛋白電泳圖Fig.1 Protein electrophoresis of rat tail collagen

      電泳圖中,其中1~4道為5 mg/m L濃度,1、2道為SIGMA公司產(chǎn)品,3、4道為自制鼠尾膠原蛋白。5、6道為20 mg/m L濃度自制鼠尾膠原蛋白,7、8道為2.5 mg/m L濃度自制鼠尾膠原蛋白。

      表1 鼠尾膠原蛋白氨基酸含量分析表Tab.1 Content analysis chart of amino acid in rat tail collagen

      3 討論

      傳統(tǒng)的提取鼠尾膠原蛋白的方法主要是中性鹽法、酸提取法、堿提取法、酶法等,但是均存在著不同程度的缺點(diǎn)。酸提取法提取迅速,但色氨酸全部被破壞,絲氨酸和絡(luò)氨酸部分被破壞;堿提取法造成膠原肽鍵被水解,含羥基和巰基的氨基酸全部被破壞且產(chǎn)生消旋;中性鹽法造成肽鏈間的離子鍵會(huì)被鹽打開造成吸水膨脹,同時(shí)擴(kuò)大生產(chǎn)的工藝不穩(wěn)定;同時(shí)以上3種方法還存在著得率低的共同缺點(diǎn),制約了鼠尾膠原蛋白的大規(guī)模提取。酶法反應(yīng)條件溫和,能保持膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu),但水解又不夠徹底。本研究所采用的新型“酸混合酶”法結(jié)合了酸提取法和酶法的優(yōu)勢(shì),解決了單一方法提取過(guò)程中存在的固有缺陷,同時(shí)通過(guò)對(duì)提取、分離、純化鼠尾膠原蛋白的單因素參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使提取得率較傳統(tǒng)工藝提高了20倍以上。確定了工藝簡(jiǎn)單、操作方便、提取得率高的鼠尾膠原蛋白提取、分離、純化方法。

      本研究所提取的鼠尾膠原蛋白經(jīng)過(guò)鑒定:(1) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定,其制備的鼠尾膠原蛋白與現(xiàn)有SIMGA公司的商業(yè)化鼠尾膠原蛋白進(jìn)行了對(duì)比,兩者圖譜無(wú)差異。從電泳結(jié)果上可以看出,制備的鼠尾膠原蛋白質(zhì)量高,純度好。其電泳結(jié)果一致。(2)樣品經(jīng)水解,經(jīng)高壓液相色譜檢驗(yàn)(樣品處理按GB/T 5009.124-2003水解,檢測(cè)方法按JY/T 024-1996),采用氨基酸分析儀,經(jīng)廣州市分析檢測(cè)中心對(duì)本研究中制備的鼠尾膠原蛋白進(jìn)行氨基酸含量分析表明,其含有①膠原蛋白特征氨基酸羥脯氨酸,含量約為8%左右;②不含胱氨酸、色氨酸這兩種氨基酸,與其自身特征相符;③甘氨酸含量接近總氨基酸含量的三分之一,與其自身特征相符。說(shuō)明制備的鼠尾膠原蛋白質(zhì)量高,達(dá)電泳純。為接下來(lái)鼠尾膠原蛋白的擴(kuò)大化生產(chǎn)提供了合適的工藝參數(shù),為大量獲得鼠尾膠原蛋白這種生物可吸收材料并進(jìn)行更深層次的功效方面研究提供了理論支持和實(shí)踐基礎(chǔ)。

      [1]張鐵良,屠軍波,楊壯群等.以鼠尾膠原蛋白為支架的真皮類似物的建立[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2006,2(15):131-134.

      [2]李艷佳,焦建麗,張佃財(cái)?shù)?在鋪有鼠尾膠原的TransWell培養(yǎng)板套皿氣-液交界面培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞形成皮膚樣器官[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù).2009,13(42):8211 -8215.

      [3]胡瑩瑩,蔣寧一,劉雄英等.鼠尾膠原三維誘導(dǎo)E14小鼠胚胎干細(xì)胞分化為甲狀腺類似細(xì)胞的初步研究[J].廣東醫(yī)學(xué).2009,3(30):327-330.

      [4]Vailhe B,Vittet D,F(xiàn)eige JJ.In vitro models of vasculogenesis and angiogenesis[J].Lab Invest,2001,81(4):439-452.

      [5]Montanez E,Casaroli-Marano RP,Vilaro S.et al.Comparative study of tube assembly in three-dimensional collagen matrix and on Matrigel coats[J].Angiogenesis,2002,5(3):167-172.

      [6]Bell E,Ivarsson B,Merribl C.Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro[J].Proc Natl Acad Sci,1979,76(3):1274-1278.

      [7]Fielding A M.Preparation of neutral salt soluble collagen[J].The Methodology of connective Tissue Research Joynson-Bruvvers,Oxford,1976:9-12.

      [8]Sajithlal GB,Chithra P,Chandrakasan G.Effect of curcumin on the advanced glycation and cross-linking of collagen in diabet in rats[J].Biochem l Pharmacol,1998,56(12):1607.

      [9]楊志明.組織工程(第1版)[M].北京.化學(xué)工業(yè)出版社,2002:217.

      [10]Schor SL,Schor AM,Winn B.et al.The use of three dimensional collagen gels for the study of tumour cell invasion in vitro:experimental parameters influencing cellm igration into the gelmatrix[J].Int JCancer,1982,15;29(1):57-62.

      [11]Kochakian M,Majula BN,Egan JJ.Chronic dosing with amino guanidine and novel advanced glycosylation and product formation inhibitors ameliorates cross-linking of tail tendon collagen in STZ-induced diabetic rats[J].Diabet es,1996,45(12):1694.

      [12]Oturai PS,Christ ensen M,Rolin B,et al.Effects of advanced glycation End-product inhibition and cross-link breackage in diabetic rats[J].Metabolism,2000,49(8):996.

      [13]張文熊,李欣,魏娜等.酶法提取膠原的研究[J].中國(guó)皮革,2006,12(23):15-17.

      猜你喜歡
      酶法膠原蛋白氨基酸
      月桂酰丙氨基酸鈉的抑菌性能研究
      UFLC-QTRAP-MS/MS法同時(shí)測(cè)定絞股藍(lán)中11種氨基酸
      中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:05
      想不到你是這樣的膠原蛋白
      Coco薇(2017年12期)2018-01-03 21:27:09
      α-生育酚琥珀酸酯的酶法合成研究進(jìn)展
      美國(guó)肉參膠原蛋白肽對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用
      膠原蛋白在食品中的應(yīng)用現(xiàn)狀及其發(fā)展前景分析
      酶法制備大豆多肽及在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用
      Sn-2二十二碳六烯酸甘油單酯的酶法合成
      梭魚骨膠原蛋白的提取及其性質(zhì)
      一株Nsp2蛋白自然缺失123個(gè)氨基酸的PRRSV分離和鑒定
      远安县| 南昌县| 合江县| 鹿泉市| 吴桥县| 连云港市| 房山区| 恭城| 朝阳县| 云和县| 夏河县| 讷河市| 崇明县| 金川县| 称多县| 丁青县| 成武县| 盐城市| 陈巴尔虎旗| 桑植县| 武陟县| 永丰县| 平顶山市| 龙口市| 阿巴嘎旗| 林西县| 宽城| 宜城市| 子洲县| 科技| 潼南县| 滨州市| 金塔县| 松滋市| 昌黎县| 阿尔山市| 娄烦县| 隆林| 新昌县| 饶平县| 阿图什市|