不同種雛鴨建立鴨乙肝病毒感染模型及抗病毒效果的實(shí)驗(yàn)

郝友華，李安意，丁紅暉，朱 帆，趙西平，楊東亮

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院臨床免疫研究室，武漢 430030； 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，武漢 430030）

鴨乙肝病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）屬嗜肝DNA病毒科，禽嗜肝DNA病毒屬，其病毒顆粒為球型，有囊膜，直徑40～50 nm。DHBV主要經(jīng)卵垂直傳播，雛鴨自然感染率高，感染后無(wú)明顯臨床癥狀。DHBV與人乙型肝肝炎病毒很類(lèi)似，因而鴨乙型肝炎病毒及及其感染模型是在當(dāng)前研究嗜肝DNA病毒復(fù)制機(jī)制和篩選抗乙型肝炎病毒藥物中扮演重要作用［1-2］。建立雛鴨感染DHBV模型的影響因素較多，本研究主要比較了不同種雛鴨DHBV自然感染率和人工感染率，以及不同人工感染DHBV方法對(duì)病毒感染率的影響，觀察了DHBV感染后鴨體內(nèi)病毒載量穩(wěn)定性，并對(duì)不同DHBV感染模型應(yīng)用抗病毒藥物抗病毒效果進(jìn)行了比較分析，對(duì)進(jìn)一步完善鴨乙肝病毒感染模型及其實(shí)際應(yīng)用有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2日齡櫻桃谷鴨雛鴨80只，購(gòu)自武漢市春江禽業(yè)有限責(zé)任公司；2日齡湖北麻鴨雛鴨分兩批次：分別為146只，產(chǎn)地湖北天門(mén)；130只，產(chǎn)地湖北漢川。人工接種DHBV病毒株，拷貝數(shù)為2.0×107copies/mL，由本研究室制備保存。Real-time PCR試劑盒為SYBR? Premix Ex TaqTM（大連寶生物工程有限公司）。

1.2.1 鴨DHBV先天感染篩查

2日齡雛鴨下肢內(nèi)側(cè)，消毒后用一次性針頭刺破表皮，取血50μL；置離心管中，37℃放置30 m in，12000 rpm×10 m in離心；分離血清，取血清煮沸10 m in，12000 rpm×10 min離心，取其上清做PCR模板，鑒定是否有DHBV自然感染。

1.2.2 鴨DHBV人工感染

未自然感染DHBV的雛鴨，分別經(jīng)靜脈注射和腹腔注射人種接種DHBV病毒株，每只200μL，接種后第10天，采血，PCR方法鑒定DHBV感染。

1.2.3 DHBV-DNA的PCR定性檢測(cè)和定量PCR檢測(cè)

根據(jù)DHBV序列分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物，定性PCR引物序列為：S1：5＇-TGG CCT AAT CGG ATT ACT GG-3＇，S2：5＇-CAG CGT GGC TAA TTG AGT TA-3；定量PCR引物序列為：P1：5＇-GATACTGGAGCC CAAACC-3＇，P2：5＇-GGCAGAGGAGGAAGTCAT-3＇，由上海invitrogen公司合成；由上海英駿公司合成。定性PCR擴(kuò)增條件分別為：94℃50 s、61℃45 s、72℃50 s、30個(gè)循環(huán)；定量PCR擴(kuò)增條件：94℃5 s、58℃5 s、72℃15 s、40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 在DHBV感染的鴨模型中觀察拉米呋啶抗病毒實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)共分為4組，每組10只鴨，分別為（1）人工感染麻鴨組，此組給予安慰劑處理：三蒸超純水，每只1 m L/kg，一天一次；（2）DHBV自然感染麻鴨組，人工感染櫻桃谷鴨組、人工感染麻鴨組，此3組口服給拉米夫定：每只100 mg/kg，一天一次，給藥15 d。實(shí)驗(yàn)各組在用藥前（D0），用藥第5天（D5），用藥第10天（D10），用藥第15天（D15）和停藥后第5天（D20），采血，定量PCR檢測(cè)DHBV-DNA載量變化。

利用云計(jì)算、大數(shù)據(jù)和移動(dòng)技術(shù)，搭建一個(gè)創(chuàng)新、開(kāi)放、便捷的綜合信息化財(cái)務(wù)管理平臺(tái)，以院、所、團(tuán)隊(duì)的財(cái)務(wù)管理為建設(shè)重點(diǎn)，創(chuàng)新預(yù)算決算、內(nèi)部控制、資產(chǎn)管理、報(bào)銷(xiāo)業(yè)務(wù)、財(cái)務(wù)分析等各項(xiàng)財(cái)務(wù)管理工作，達(dá)到快速、準(zhǔn)確、高效的管理效果，逐步實(shí)現(xiàn)預(yù)算的綜合管理，內(nèi)部控制的環(huán)環(huán)相扣，資產(chǎn)管理信息完整翔實(shí)，報(bào)銷(xiāo)業(yè)務(wù)的快速便捷，財(cái)務(wù)分析的及時(shí)準(zhǔn)確，逐步促成科技創(chuàng)新成果的全成本核算。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件（13.0版本）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.01為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 DHBV在不同鴨種中自然感染率比較

分別采集櫻桃谷鴨、湖北麻鴨的血清，以處理后的血清為模板，應(yīng)用定性PCR方法擴(kuò)增DHBV片段，PCR產(chǎn)物大小為422 bp即為陽(yáng)性。經(jīng)檢測(cè)在80只櫻桃谷鴨血清中，DHBV陽(yáng)性有7只，陽(yáng)性率為8.75％；146只湖北天門(mén)麻鴨（湖北麻鴨-1），DHBV陽(yáng)性有26只，陽(yáng)性率為17.80％，131只湖北漢川麻鴨（湖北麻鴨-2），DHBV陽(yáng)性有14只，陽(yáng)性率為10.68％（圖1）。統(tǒng)計(jì)分析顯示：湖北麻鴨-1的自然感染率明顯高于其它2組（P＜0.01）。

2.2 不同人工接種方法致雛鴨DHBV感染率比較

靜脈注射和腹腔注射是DHBV人工感染雛鴨的兩種常用方法。分別取20只未感染DHBV湖北麻鴨雛鴨，用同一DHBV陽(yáng)性毒株，經(jīng)鴨腿脛靜脈注射和腹腔注射病毒；并與10只未感染DHBV的湖北麻鴨雛鴨一起飼養(yǎng)，10 d后采集鴨血清，定性PCR方法檢測(cè)DHBV陽(yáng)性率，結(jié)果顯示：20只雛鴨靜脈注射組，有16只出現(xiàn)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為80％，20只雛鴨腹腔注射組13只陽(yáng)性，陽(yáng)性率為65％，未感染組沒(méi)有出現(xiàn)DHBV陽(yáng)性個(gè)體鴨（圖2）。

圖1 鴨乙肝病毒在雛鴨中的自然感染率（＊＊有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）Fig.1 Natural infection rate of duck hepatitis B virus in ducklings（＊＊Statistical significance）

圖3 不同鴨種人工接種后DHBV感染率Fig.3 Infection rates in the different duckspecies by artificial inoculation

圖2 不同人工接種方法致雛鴨DHBV感染率Fig.2 Infection rates in ducklings caused bydifferent artificial inoculation methods

2.3 不同鴨種人工接種DHBV感染率比較

分別取未感染DHBV的櫻桃谷鴨和湖北麻鴨雛鴨各70只，用同一DHBV病毒株，經(jīng)腹腔注射途徑人工感染兩種鴨雛鴨，10 d后采集鴨血清，PCR方法檢測(cè)DHBV感染狀況。結(jié)果顯示：有48只櫻桃谷鴨DHBV陽(yáng)性，陽(yáng)性率68.57％；有44只湖北麻鴨DHBV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為62.85％。二者間無(wú)明顯差異（P＞0.05）（圖3）。

2.4 DHBV感染后鴨體內(nèi)病毒血癥變化

為觀察DHBV感染后鴨體內(nèi)病毒DNA載量的變化，分別對(duì)DHBV自然感染陽(yáng)性湖北麻鴨、人工感染DHBV陽(yáng)性的櫻桃谷鴨和湖北麻鴨3組，各10只，從13日鴨齡開(kāi)始，每間隔7 d，采集鴨血清，定量PCR檢測(cè)病毒DNA的載量，連續(xù)觀察28 d。結(jié)果見(jiàn)圖4。3類(lèi)DHBV感染鴨體內(nèi)病毒載量維持在106～108copies/m L，3組間DNA載量變化無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

2.5 在DHBV感染鴨模型中拉米呋啶抗病毒效果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，分別給予安慰劑和拉米呋啶抗病毒藥物處理，每組使用的動(dòng)物分別為：處理組-1為櫻桃谷鴨人工感染、處理組-2為湖北麻鴨人工感染、處理組-3為湖北麻鴨自然感染、安慰劑組為麻鴨人工感染。在用藥前（D0），用藥第5天（D5），用藥第10天（D10），用藥第15天（D15）和停藥后第5天（D20），采血，定量PCR檢測(cè)DHBV-DNA載量變化。結(jié)果見(jiàn)圖5：給藥后第10，15天后，除安慰劑組外，其余3組鴨血清DHBV-DNA顯著降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，病毒下降有顯著的統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）；停藥5 d后，鴨體內(nèi)DHBV-DNA滴度都出現(xiàn)了明顯的反彈；3組間病毒變化趨勢(shì)一致；但給予安慰劑組，鴨體內(nèi)DHBV病毒沒(méi)出現(xiàn)明顯下降和反彈。

圖4 DHBV感染后鴨體內(nèi)病毒DNA載量的變化Fig.4 Changes of in vivo viral DNA load in DHBV-infected ducks

圖5 抗病毒藥物在不同鴨模型中抗病毒效果Fig.5 Antiviral effects of the drug in different duck models

3 討論

鴨乙肝病毒在不同種雛鴨中自然感染率存在明顯差異［3］。本研究應(yīng)用PCR方法，比較了湖北麻鴨和櫻桃谷對(duì)DHBV感染率，結(jié)果顯示：湖北地區(qū)孵化的櫻桃谷鴨DHBV自然感染為8.75％，湖北麻鴨DHBV自然感染率約為10％～20％；湖北麻鴨自然感染DHBV的比率明顯高于櫻桃谷鴨，與瞿滌等前期研究結(jié)果類(lèi)似［4］。但即使是同為湖北麻鴨種，因來(lái)源不同其自然感染率也不同，這提示除了鴨的種類(lèi)差異影響DHBV的自然感染率外，人工孵育鴨的不同方式也可能是影響其自然感染率不容忽視的重要因素。

雛鴨人工感染DHBV是制備鴨乙肝病毒感染模型的重要措施，其主要受人工感染的途徑和雛鴨種類(lèi)的影響［5］。人工感染的途徑比較多，但以鴨腿脛靜脈注射和腹腔注射途徑感染最為常用。本研究比較了這兩種途徑感染DHBV的感染率。結(jié)果顯示：這兩種途徑均能使雛鴨感染DHBV，但靜脈注射途徑感染率明顯高于腹腔注射。而鴨種對(duì)人工感染率的影響不明顯，本研究中不同種雛鴨人工感染DHBV后的感染率分別是：櫻桃谷鴨為68.57％，湖北麻鴨為62.85％，二者間無(wú)明顯差異。這提示鴨的種類(lèi)不是影響DHBV實(shí)驗(yàn)感染雛鴨是否易感的主要因素。此外，本實(shí)驗(yàn)中將未自然感染DHBV的雛鴨與人工感染DHBV的雛鴨一起飼養(yǎng)，10 d后，這些鴨體內(nèi)DHBV仍為陰性，提示DHBV傳播主要以垂直傳播途徑為主，水平傳播途徑對(duì)病毒的傳播影響較小。

DHBV感染鴨后，鴨體內(nèi)病毒血癥的穩(wěn)定性和持續(xù)時(shí)間是成功建立鴨人工感染DHBV實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭匾獏?shù)［6］。本研究比較了人工DHBV感染鴨和自然感染后，鴨體內(nèi)的病毒血癥和持續(xù)時(shí)間，結(jié)果顯示：鴨體內(nèi)病毒血癥在不同途徑感染中都能穩(wěn)定持續(xù)存在；但自然感染的鴨中，不同個(gè)體病毒DNA載量波動(dòng)較大；在病毒持續(xù)時(shí)間上無(wú)明顯差異。此外，本研究還比較了抗病毒藥物在不同DHBV感染模型中抗病毒效果，結(jié)果顯示：人工感染組和自然感染組抗病毒效果的變化趨勢(shì)具有較好的一致性，而且鴨種的差異對(duì)其也無(wú)明顯影響。但櫻桃谷鴨個(gè)體較大，實(shí)驗(yàn)中用藥量等耗量也較大，這在該模型的實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)考慮。

總之，鴨的種類(lèi)，繁殖方式及人工感染途徑均影響著DHBV感染率，雖然DHBV感染雛鴨后，鴨體內(nèi)均可有持續(xù)性的病毒血癥；但在建立鴨乙肝病毒感染模型中，為保證不同組別間病毒血的基線特征一致性、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可比較性，應(yīng)盡量選擇未有DHBV感染的1～3日齡雛鴨進(jìn)行人工感染建立模型，而且最好選用同一來(lái)源、同一批次的毒株作為感染源。

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