中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究方法評(píng)述Δ

樸勝華，羅朵生（1.廣東藥學(xué)院中醫(yī)藥研究院，廣州 510006；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局高脂血癥調(diào)肝重點(diǎn)研究室/國(guó)家中醫(yī)藥管理局脂代謝三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究方法評(píng)述Δ

樸勝華1，2＊，羅朵生1，2（1.廣東藥學(xué)院中醫(yī)藥研究院，廣州 510006；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局高脂血癥調(diào)肝重點(diǎn)研究室/國(guó)家中醫(yī)藥管理局脂代謝三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

目的：探討中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路。方法：查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)拆方研究法與整方研究法、代謝研究法與血清藥物化學(xué)法、中藥有效組分模式與譜效關(guān)系研究法、分子生物色譜技術(shù)與多靶點(diǎn)篩選技術(shù)以及系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)與不足進(jìn)行總結(jié)、分析與比較。結(jié)果：上述方法的不足體現(xiàn)在對(duì)藥效物質(zhì)的辨識(shí)和篩選時(shí)脫離了中醫(yī)藥理論，忽視了中藥有效成分在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。由于現(xiàn)有分析手段的局限性以及定性過(guò)程較復(fù)雜等原因，限制了上述方法的廣泛應(yīng)用。結(jié)論：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究應(yīng)依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，遵循中藥的整體性、協(xié)同性和多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)，最大限度地綜合運(yùn)用現(xiàn)代相關(guān)技術(shù)去揭示中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)。

中藥；物質(zhì)基礎(chǔ)；研究方法；綜述

Δ廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研課題（2008177）

＊副研究員，博士。研究方向：中醫(yī)藥防治代謝紊亂性疾病。電話：020-39352609。E-mail：piaow@163.com

中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)之一，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要組成部分，對(duì)控制中藥質(zhì)量、闡明有效成分及其作用原理具有重要意義。但由于中藥作用的整體性、成分和作用機(jī)制的復(fù)雜性，使得中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展緩慢，這已成為制約中藥現(xiàn)代化的一個(gè)瓶頸[1]。尋找適合中藥復(fù)雜體系物質(zhì)基礎(chǔ)的研究方法，一直是中藥研究的關(guān)鍵問(wèn)題，并已列入國(guó)家中長(zhǎng)期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006－2020年）、重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)和中醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展規(guī)劃綱要（2006－2020年）相關(guān)領(lǐng)域和主題的重要內(nèi)容。因此，針對(duì)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的諸多難點(diǎn)，進(jìn)行方法學(xué)創(chuàng)新，發(fā)展具有普遍適用意義的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究方法學(xué)，將對(duì)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的可持續(xù)、高速發(fā)展產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用。本文擬就近年來(lái)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)研究方法、特點(diǎn)與不足作一綜述。

1 拆方研究法和整方研究法

拆方研究法是以復(fù)方的君、臣、佐、使組方原則或功效為主要導(dǎo)向，對(duì)復(fù)方中藥進(jìn)行篩選。即逐步減去復(fù)方中一味或幾味中藥，拆成單味藥或藥物組，以觀察療效變化，逐漸縮小研究范圍，最終確定必須保留的藥物，從中尋找有效成分。拆方法可研究復(fù)方的組成原則和配伍作用。近年來(lái)，有學(xué)者對(duì)血府逐瘀湯[2]、吳茱萸湯[3]等進(jìn)行了拆方研究，發(fā)現(xiàn)了具有代表性的有效成分。但拆方法忽視了方藥合煎的影響以及成分之間的相互作用。

隨著現(xiàn)代分析、分離、鑒定方法與技術(shù)的引入，整方研究法在一定程度上克服了拆方法的局限性，在許多復(fù)方研究中得以應(yīng)用。整方研究法是將復(fù)方視為一個(gè)整體，研究中運(yùn)用植化方法對(duì)復(fù)方煎煮后的藥液進(jìn)行系統(tǒng)分離和鑒定，以獲得全方化學(xué)信息。還可結(jié)合單味藥成分，分析整方與單味藥的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)煎煮等過(guò)程中有無(wú)新化合物生成等。如，從麻醉復(fù)方整方中分離獲得東莨菪堿[4]，從白頭翁湯中獲得生物堿、香豆素、皂苷、檸檬苦素4類化學(xué)成分等[5]。但整方中化學(xué)成分更加復(fù)雜，涉及面更廣，工作難度更大。將整方法與拆方法結(jié)合運(yùn)用，有助于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的全面闡釋。

2 代謝研究法和血清藥物化學(xué)法

代謝研究法是通過(guò)給藥后對(duì)動(dòng)物血液、尿、膽汁、胃液、腸液、糞便等進(jìn)行分離、分析，從而發(fā)現(xiàn)復(fù)方在體內(nèi)發(fā)揮藥效的物質(zhì)。其中，多集中在研究給藥后的動(dòng)物血液上，即血清藥物化學(xué)法。

中藥復(fù)方成分雖復(fù)雜，但進(jìn)入體內(nèi)且被檢測(cè)到的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量有限。進(jìn)入血液的成分包括復(fù)方的原型單體、腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物，以及它們對(duì)機(jī)體直接作用后產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)。代謝研究法排除了復(fù)方本身復(fù)雜理化性質(zhì)、胃腸中不能進(jìn)入血清的藥物成分等干擾，可更快速地發(fā)現(xiàn)有效成分。用代謝研究法對(duì)小柴胡湯進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，服用小柴胡湯后血漿中發(fā)現(xiàn)了原方中沒(méi)有的一些新化合物，如黃芩苷的新代謝物黃芩苷元硫酸酯等[6]。對(duì)茵陳蒿及其復(fù)方進(jìn)行的血清藥物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，口服給藥后，具有促進(jìn)膽汁分泌作用的6，7-Dimethylesculetin（6，7-DME）被大量吸收入血，其余藥物成分可能在其他環(huán)節(jié)對(duì)6，7-DME產(chǎn)生影響，但在血液中并未檢出，由此認(rèn)定，6，7-DME為茵陳蒿和茵陳蒿湯的物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。

然而，該法在實(shí)際運(yùn)用中也遇到了較多問(wèn)題。首先，在血清中檢測(cè)到的成分可能是無(wú)效物質(zhì)或是有效物質(zhì)的代謝產(chǎn)物；其次，某些吸收入血檢測(cè)到的成分，經(jīng)過(guò)富集和提純后，需比原來(lái)血清中的濃度高許多倍時(shí)才顯示相關(guān)藥理作用，這給有效成分的確定帶來(lái)困難。此外，不同種屬、年齡的動(dòng)物對(duì)藥物吸收的差異，不同給藥劑量、采血時(shí)間造成的血藥成分、濃度的差異，加上血清內(nèi)源性成分的干擾，給血清有效成分的分離、鑒定造成了較大的困難。因此，中藥血清藥物化學(xué)雖是一種很有發(fā)展前途的方法，但許多問(wèn)題尚待今后更系統(tǒng)深入的探討。

3 中藥有效組分模式和譜效關(guān)系研究法

中藥有效組分，是指從一味中藥或復(fù)方中藥中提取的一類或幾類化學(xué)成分的混合體，且這一類或幾類已知化學(xué)成分被認(rèn)為是有效組分。與原藥材相比，它富集了有效物質(zhì)。由于中藥復(fù)方的整體層次過(guò)于復(fù)雜，而單一成分又常失去中醫(yī)藥的特色，因此有效組分的研究顯得尤為重要。

譜效關(guān)系是建立在指紋圖譜的研究之上，應(yīng)用色譜及其聯(lián)用技術(shù)，最大限度地獲取有用的化學(xué)信息。通過(guò)對(duì)有效組分進(jìn)行譜效關(guān)系研究，將標(biāo)示活性成分群特征峰的指紋圖譜與藥效結(jié)果對(duì)應(yīng)起來(lái)，將中藥指紋圖譜中化學(xué)成分的變化與藥效結(jié)果聯(lián)系起來(lái)，建立譜效關(guān)系，探討復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。如，石鉞等[9]利用高效液相色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜提供的色譜和離子碎片信息，對(duì)相同試驗(yàn)條件下提取的銀翹散中抗流感病毒有效組分及其組方各單味藥的指紋圖譜流出組分進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果，對(duì)銀翹散中抗流感病毒有效組分指紋圖譜中的30個(gè)共有色譜峰，在單味藥中歸屬了其中的29個(gè)峰，基本實(shí)現(xiàn)了銀翹散中抗流感病毒有效組分與其單味藥中各組分的歸屬，確定了該方的物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 分子生物色譜技術(shù)與多靶點(diǎn)篩選技術(shù)

分子生物色譜技術(shù)與多靶點(diǎn)篩選技術(shù)的基本方法均是針對(duì)中藥復(fù)方多成分調(diào)節(jié)作用的多靶點(diǎn)特性，通過(guò)配體-受體的藥物研究理論，進(jìn)行藥效物質(zhì)的篩選、確定。

分子生物色譜技術(shù)包括固定血清蛋白生物色譜、固定生物膜色譜等。其操作過(guò)程是將生物體內(nèi)活性物質(zhì)如酶、受體、運(yùn)輸?shù)鞍缀推渌哂兄匾砉δ艿纳锎蠓肿庸潭ㄓ谏V填料中，復(fù)方提取物通過(guò)色譜柱后，經(jīng)過(guò)特異識(shí)別、結(jié)合和分離，最終被分離和鑒定。如，Wang HL等[10]用人血清白蛋白（HSA）生物色譜技術(shù)研究了茵陳蒿的甲醇提取物在色譜柱上的結(jié)合狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)保留峰，并鑒定出其中的2個(gè)化合物分別為濱蒿內(nèi)酯和茵陳新，說(shuō)明這2個(gè)化合物具有生理活性。Mao X等[11]首先采用固定脂質(zhì)體柱色譜（ILC）的方法篩選當(dāng)歸中的活性成分，從ILC的色譜圖中找到了10個(gè)色譜峰，其中2個(gè)化合物鑒定為阿魏酸、藁本內(nèi)酯，二者曾被報(bào)道是當(dāng)歸中最重要的有效成分。但該法使用的是自然生物膜，膜受體的密度較小，柱效較低；色譜柱壽命通常比較短，且常受非特異結(jié)合因素的干擾，其有效成分并不一定是與受體結(jié)合，有可能通過(guò)其他形式影響受體的功能，不能完全模擬體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境，這給有效成分的研究帶來(lái)很大困難。

以基因、受體、酶等為藥物作用靶點(diǎn)的高通量篩選技術(shù)在中藥有效成分篩選、分離等的研究中發(fā)揮了重要作用。Sun X等[12]用細(xì)胞外膜片鉗技術(shù)構(gòu)建體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元模型，篩選了22種中藥對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸受體的拮抗作用。結(jié)果顯示，黃芩、粉防己、鼠尾草等水提取物能阻斷N-甲基-D-天冬氨酸的通路。el-Mekkawy S等[13]以尋找HIV-1受體拮抗藥為目標(biāo)，從靈芝子實(shí)體所包含的化合物中發(fā)現(xiàn)Ganoderiol F和Ganodermanontriol有抗HIV-1受體的活性。但是高通量篩選的局限性也十分明顯，主要表現(xiàn)在該技術(shù)不能充分反映藥物的全面藥理作用，也無(wú)全面反映機(jī)體生理機(jī)能的理想模型。

5 系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)

系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)主要研究一個(gè)生物系統(tǒng)中所有組成成分如基因、mRNA、蛋白質(zhì)等的構(gòu)成，以及在特定條件下這些組分間的相互關(guān)系[14]。

復(fù)方是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下治療疾病的主要應(yīng)用方式，其療效是體內(nèi)多靶點(diǎn)協(xié)同作用的綜合結(jié)果，體現(xiàn)了整體性特點(diǎn)。系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)在很大程度上符合中藥整體性作用特點(diǎn)，為解開(kāi)復(fù)方“黑箱”之謎提供了有力武器。在系統(tǒng)生物學(xué)體系中，代謝組學(xué)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，在研究機(jī)體正常狀態(tài)-疾病-中藥這個(gè)有機(jī)系統(tǒng)時(shí)體現(xiàn)了一定的優(yōu)勢(shì)。一方面，可研究生命體代謝網(wǎng)絡(luò)在疾病和中藥干預(yù)下，所引起的內(nèi)源性物質(zhì)代謝的變化或隨時(shí)間的變化；另一方面，把中藥作為一個(gè)有機(jī)整體，對(duì)中藥成分在體內(nèi)的代謝變化情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤監(jiān)測(cè)、定量和分類。通過(guò)比較正常、病理、服藥后生命體代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜差異，借助化學(xué)計(jì)量學(xué)等手段，將這些代謝信息與病理、生理過(guò)程中的生物學(xué)事件、中藥提取物中的有效成分關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而確定發(fā)生這些變化的靶器官和作用位點(diǎn)，進(jìn)而確定相關(guān)的生物標(biāo)志物（組），認(rèn)識(shí)疾病的本質(zhì)，找出中藥提取物中的相關(guān)物質(zhì)，揭示中藥成分結(jié)構(gòu)-代謝-活性的相關(guān)性，闡明中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制[15]。代謝組學(xué)分析的流程包括樣品的制備、數(shù)據(jù)的采集和數(shù)據(jù)的分析及解釋等。其中分離、分析手段及其組合的應(yīng)用在代謝組學(xué)研究中較為關(guān)鍵，后期還需借助于生物信息學(xué)平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析和解釋。目前，代謝組學(xué)技術(shù)主要存在分析手段局限、定性過(guò)程復(fù)雜、全部組分定量分析難以實(shí)現(xiàn)、準(zhǔn)確性不足等弊端，這在一定程度上限制了它的廣泛應(yīng)用[16]。

王喜軍等[17]將代謝組學(xué)應(yīng)用于茵陳蒿湯的研究，表征了大鼠肝損傷的5個(gè)內(nèi)源性特征生物標(biāo)記物，茵陳蒿湯對(duì)標(biāo)記物造模后的回調(diào)作用明顯，說(shuō)明茵陳蒿湯對(duì)肝炎的預(yù)防作用顯著，從藥物代謝組學(xué)角度對(duì)經(jīng)典方劑防治肝損傷給出了全新解釋。Yu Y等[18]用代謝組學(xué)方法尋找耬斗菜中的抗菌活性物質(zhì)，最終得出Maguoflorine為其抗金黃色葡萄球菌的主要活性成分，并認(rèn)為耬斗菜的體內(nèi)作用靶點(diǎn)與林可霉素、氯霉素、鏈霉素以及四環(huán)素的靶點(diǎn)相同。

6 討論

綜上所述，中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究經(jīng)多年的探索努力，已建立了一些有效的方法（如圖1）。從研究對(duì)象切入點(diǎn)來(lái)看，可分為以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為出發(fā)點(diǎn)的研究方法，如代謝及血清藥物化學(xué)研究技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)等；以中藥為出發(fā)點(diǎn)的研究方法，包括整方與拆方研究法、有效組分與譜效關(guān)系研究法、分子生物色譜及高通量篩選技術(shù)等。

但就現(xiàn)狀而言，對(duì)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究還不夠深入。原因主要有：（1）中藥藥效物質(zhì)的辨識(shí)和篩選技術(shù)脫離了中醫(yī)藥理論，只是簡(jiǎn)單地引入現(xiàn)代藥物化學(xué)和藥理學(xué)等理論和手段，基本走上了“中藥西化”的道路，與中醫(yī)藥整體觀及多成分、多靶點(diǎn)整體作用特點(diǎn)不甚吻合。如，傳統(tǒng)的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究往往遵循先化學(xué)分離、后分析鑒定，再結(jié)合藥理實(shí)驗(yàn)以確定主成分的活性導(dǎo)向方法，應(yīng)用此法雖能闡明很多中藥活性成分，但這樣的分離、分析操作煩瑣、周期長(zhǎng)，并且不能完全闡明中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。（2）中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究沒(méi)有重視中藥有效成分體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。傳統(tǒng)的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究模式重點(diǎn)考察中藥中含有哪些成分、哪些成分能在藥理實(shí)驗(yàn)中顯示活性，沒(méi)有重視其中的化學(xué)成分是否能夠被吸收以及吸收后在體內(nèi)的系列變化過(guò)程。眾所周知，任何藥物都是通過(guò)與人體的相互作用而發(fā)揮療效的，因此中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究應(yīng)該緊扣人體對(duì)藥物的作用，充分考慮中藥有效成分在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程（吸收、分布、代謝、靶向等），闡明體內(nèi)發(fā)揮療效的真正藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。（3）中藥成分復(fù)雜，現(xiàn)有的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)仍存在許多不足與弊端。

因此，可依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，遵循中藥的整體性、協(xié)同性和多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)，借鑒現(xiàn)代化學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的最新技術(shù)和方法，如高效液相色譜-二極管陣列-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法聯(lián)用技術(shù)、液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等，從中藥活性成分的生成、吸收、分布、靶向作用和代謝的全過(guò)程對(duì)中藥開(kāi)展系統(tǒng)的研究，建立一種動(dòng)物體內(nèi)模擬的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)篩選新方法（如圖2），最大限度地綜合運(yùn)用現(xiàn)代相關(guān)技術(shù)去揭示中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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